基于TLR4/MYD88 信号通路探讨大黄牡丹汤对急性胰腺炎大鼠模型的保护作用

宋冰汪永锋余四九∗张延英康万荣

(1. 甘肃农业大学,兰州 730070; 2. 甘肃中医药大学,甘肃省实验动物行业技术中心,兰州 730000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)在临床中较为常见,是外科急腹症之一,该病发病较急,经常出现局部和胰腺外并发症,导致全身炎症反应综合征和序贯性多器官功能障碍综合征[1]。现代医学关于该病的治疗,主要强调早期控制,尚无特效疗法。而近年在临床治疗中发现[2-3]及时使用中医药对恢复胃肠道功能可起到积极作用,同时可以间接减少多种并发症的发生发展,有效增强治疗效果,降低死亡率。王勋等[4]通过临床观察发现,大黄牡丹汤干预AP 患者,能够显著改善患者腹痛腹胀、恶心呕吐等症状,尿淀粉酶、血淀粉酶、血白细胞等相关数值有显著下降。因此,深入研究大黄牡丹汤防治急性胰腺炎意义重大。

目前,Frossard 等[5]发现在胰腺腺泡细胞内,包括胰蛋白酶在内的广泛酶激活现象能够促使腺体自溶、局部炎症、细胞坏死,进而引起氧自由基的产生和血管损伤,级联式放大促炎条件,加重胰腺组织损伤。本课题组前期研究表明大黄牡丹汤新方能够显著改善AP 大鼠胰腺病理组织改变,并能够显著下调AP 大鼠血清内炎性因子含量,然而关于大黄牡丹汤有效干预急性胰腺炎发病的具体分子机制尚不明晰[6]。刘涛等[7]报道在非酒精性脂肪肝大鼠模型中使用大黄素能够抑制大鼠肝内Toll 样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MYD88)的表达。故本研究复制AP 动物模型,研究大黄牡丹汤对AP模型大鼠TLR4/MYD88 信号通路关键分子TLR4、MYD88、白细胞介素-1 受体相关激酶2(interleukin-1 receptorassociated kinase 2,IRAK-2)和白细胞介素 - 1 受体相关激酶 4 (interleukin - 1 receptorassociated kinase 4,IRAK-4)表达以及下游炎性因子白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)、γ 干扰素(interferon-γ,INF-γ)、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)含量的影响,以探讨急性胰腺炎发病的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

96 只2 月龄SPF 级Wistar 大鼠,雌雄各半,体重(200 ± 20)g,购自甘肃中医药大学SPF 级实验动物中心【SCXK(甘)2015-0002】。于甘肃中医药大学SPF 级实验室常规饲养【SYXK(甘) 2015 -0005】,相对湿度45% ～ 55%,室温(23 ± 2)℃,12 h光暗周期循环,常规标准饲料喂养,自由水食,适应性喂养3 d 后进行实验,实验过程中所有操作均遵守甘肃中医药大学实验动物伦理原则(审批号:2017-048)。

1.1.2 主要试剂与仪器

大黄牡丹汤药材购自甘肃中医药大学附属医院,由甘肃中医药大学李越峰教授鉴定为正品。实验处方[8]:大黄12 g、牡丹皮9 g、桃仁12 g、冬瓜子30 g、芒硝9 g,由甘肃中医药大学附属医院药剂科制剂室提供,应用多功能提取罐,所有药材除芒硝外加10 倍量蒸馏水浸泡4 h,按常法煎煮2 次,每次40 min,滤出药液中加入芒硝,用旋转蒸发仪浓缩,达到每1 mL 药液中生药含量为4 g,经高温灭菌,在室温下冷却,放入冰箱4℃冷藏备用。

奥曲肽(国药一心制药有限公司,170504);大鼠白细胞介素6(IL-6)试剂盒、大鼠白细胞介素2(IL-2)试剂盒、大鼠γ 干扰素(INF-γ)试剂盒、大鼠一氧化氮合酶(iNOS)试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司, 1907R); 反转录试剂盒(Promega,0000366052);Real time qPCR 试剂盒(TaKaRa,#AI82513A);GAPDH 抗体(ImmunoWay,B1501);TLR4 抗体(GeneTex,NO.821904926);MYD88 抗体(ImmunoWay,B2801);IRAK-2 抗体(GeneTex,NO.821904926 ); IRAK-4 抗 体 (GeneTex, NO.821904926);HRP-羊抗兔IgG(博士德生物工程有限公司,BST13C23C54)。

微量注射泵(深圳圣诺医疗设备有限公司,SN-50T6,中国);高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份有限公司,SCIENTZ-48,中国);高速低温离心机(Eppendorf,5910R,美国);逆转录仪(BIO-RAD,S1000TM,美国);凝胶成像分析系统(BIO-RAD,Chemi DOC XRS+,美国);酶联免疫检测仪(BIORAD,Benchmark Plus,美国);实时定量PCR 仪(Roche,瑞士);超微量分光光度计(Putton,美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型复制

参见文献[9-10],大鼠在造模前12 h 禁食但不禁水,手术前采用腹腔注射3%戊巴比妥钠方式进行麻醉,麻醉后仰卧固定于大鼠固定板上,常规备毛,消毒处理后,于剑突下切开,充分显露十二指肠与胰胆管,采用无损伤血管夹双重夹闭胰胆管远端胆管近肝门处,使用0.45 mm 头皮针通过十二指肠外壁穿刺进入肠腔,经胰胆管开口于十二指肠处的乳头穿入胰胆管,用无损伤血管夹固定针头。将新鲜配置5%牛磺胆酸钠溶液(1 mL/kg)使用微量泵恒速(0.1 mL/mim)向主胰管内注入,注射完成后,无损伤血管夹继续夹闭5 min,以保证药物可以充分进入胰腺小叶,5 min 后将血管夹取下,整复十二指肠,分层缝合关腹。假手术组的操作与上述基本相同,但把注入胰胆管内液体改为生理盐水。模型评价标准:一般生存状况观察、血液生化指标、胰腺组织病理学变化。

1.2.2 动物分组及实验干预

大黄牡丹汤剂量参考《中药药理实验方法学》[11],根据临床用量的体重折算,大鼠的等效剂量约为7 g/kg,即大黄牡丹汤中剂量组;按照等比级数分组确定大黄牡丹汤高、低剂量组的给药剂量分别为14 g/kg、3.5 g/kg。(国药一心制药有限公司)奥曲肽(针对重症胰腺炎)临床使用剂量为皮下注射0.1 mg,根据临床用量的体重折算,大鼠的等效剂量约为10 μg/kg。

Wistar 大鼠分为:(1)假手术组(行假手术,灌胃生理盐水),即A 组;(2)AP 模型观察组(上述方法造模,灌胃生理盐水),即B 组;(3)奥曲肽阳性对照组(上述方法造模,皮下注射奥曲肽10 μg/kg),即C 组;(4)大黄牡丹汤高剂量(上述方法造模,灌胃大黄牡丹汤14 g/kg)组,即D 组;(5)大黄牡丹汤中剂量(上述方法造模,灌胃大黄牡丹汤7 g/kg)组,即E 组;(6)大黄牡丹汤低剂量(上述方法造模,灌胃大黄牡丹汤3.5 g/kg)组,即F 组。每组16 只,除假手术组经胰胆管逆行注射生理盐水,其余各组均同上采用牛磺胆酸钠溶液造模。

1.2.3 形态指标测试及取材

记录各组大鼠的摄食量和体重。药物干预6 d后,心脏采血后颈椎脱臼法处死,分离血清冻存,剖取胰腺组织,生理盐水清洗干净后,部分使用组织固定液固定以备病理切片观察以及免疫组化检测,剩余组织冻存在超低温冰箱(-80℃),用于后期检测炎症因子、基因和蛋白表达水平。

1.2.4 血清生化学指标检测

取冻存血清, 用生化分析仪检测淀粉酶(AMS)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)含量。

1.2.5 HE 染色观察胰腺组织病理学改变

取多聚甲醛固定后的胰腺组织,石蜡包埋、切片,依次进行二甲苯梯度脱蜡→乙醇脱水→苏木素染色→分化液分化→流水冲洗→乙醇梯度脱水→伊红染色→乙醇梯度脱水→二甲苯透明→中性树胶封片。10 × 10 倍镜下拍照,观察大鼠胰腺组织病理改变。

1.2.6 实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测胰腺组织基因表达

取胰腺病灶组织,加入TRIzol 提取总RNA。采用超微量分光光度计测定其浓度以及OD260/OD280 比值。采用Promega 公司反转录试剂盒配置20 μL 体系将RNA 反转录为cDNA 以备PCR 扩增反应。引物委托宝生物工程(大连)有限公司制备,序列见表1。选取β-Actin 作为内参基因,得到各扩增反应的Ct 值,采用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA 相对表达量。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for each gene

1.2.7 Western Blot 测试胰腺组织蛋白表达

取胰腺病灶组织,加入组织裂解液提取总蛋白,采用BCA 试剂盒对蛋白提取液进行定量分析,随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,120 V 恒压转至PVDF 膜,室温封闭3 h,一抗4℃冰箱孵育过夜,TBST 洗膜3 次,二抗室温孵育2 h,TBST 洗膜3 次,最后采用化学发光底物进行化学发光,显影后用Bio-RAD Quantity one 图像分析软件进行扫描分析,并使用Image J 软件进行数据分析。

1.2.8 免疫组化法(IHC)测试胰腺组织蛋白表达

取固定后胰腺组织进行石蜡包埋,切片,常规脱蜡至水,阻断内源性过氧化物酶,血清封闭;滴加一抗至切片,4℃孵育过夜;滴加二抗至切片,室温孵育1 h;应用DAB 液进行显色,完成后自来水冲洗,终止反应;复染细胞核,脱水封片;光镜下观察大鼠胰腺组织中蛋白表达情况,棕黄色为阳性染色;通过Image J 分析并计算各组的平均光密度(IOD)值。

1.2.9 酶联免疫法(ELISA)测试胰腺组织中炎性因子IL-2、iNOS 及IFN-γ 含量

取胰腺病灶组织,加入生理盐水制备组织匀浆液,采用江苏菲亚生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒进行检测,严格按照ELISA 试剂盒说明书进行操作,配制并滴加标准品、组织匀浆液稀释液,依次加入酶标试剂及显色剂A、B,最后于酶标仪上读取光度值,按照说明书绘制标准曲线,并计算炎性因子含量。

1.3 统计学分析

计量资料以平均值± 标准差(±s)表示。实验数据均采用SPSS 22.0 和Graph Pad Prism 8 软件处理,多组间比较先进行方差齐性检验,方差齐者两两比较应用LSD-t检验,方差不齐用Tamhane’s T2 法比较。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般生存状况观察

假手术组大鼠表现为反应灵敏、皮毛浓密光泽、活动度正常。而AP 模型观察组大鼠造模后表现为眯眼、被毛杂乱失泽、倦卧嗜睡。各药物干预组大鼠在治疗期间观测到被毛杂乱失泽、反应迟钝、少食怠动、消瘦倦卧、逐渐减轻,尤其以大黄牡丹汤高剂量组大鼠一般生存状况改善明显。

2.2 生化指标检测

如图1 所示,与假手术组比较,AP 模型观察组大鼠AMS、ALT、AST 含量显著降低组间差异有统计学意义(P＜0.05);与AP 模型观察组比较,各治疗组大鼠AMS、ALT、AST 均有下降趋势,其中尤以大黄牡丹汤高剂量组显著,组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 大鼠胰腺组织病理改变

干预6 d 后,各组大鼠胰腺组织病理改变如图2所示,假手术组(A 组)大鼠的胰腺组织腺泡以及小叶导管结构未见异常,未观察到明显的水肿、充血和炎性细胞浸润;AP 模型观察组(B 组)大鼠的胰腺组织腺泡细胞大量坏死,小叶导管结构模糊,叶间隔明显增宽,可见大量充血、水肿以及炎性细胞浸润;奥曲肽阳性对照组及大黄牡丹汤高、中、低剂量组大鼠的胰腺组织腺泡细胞坏死,小叶导管结构模糊,叶间隔增宽,可见出血以及炎性细胞浸润,但均较AP 模型观察组(B 组)大鼠不同程度减轻,尤以大黄牡丹汤高剂量组显著。

图1 大黄牡丹汤对血清生化学指标的影响Note. Compared with the group A,#P＜0.05. Compared with group B, ∗P＜0.05.(The same in the following figures)Figure 1 Effect of Dahuang Mudan Decoction on biochemical indexes of serum

图2 大黄牡丹汤对胰腺组织病理的影响(× 100)Figure 2 Effect of Dahuang Mudan Decoction on pancreatic histopathology(× 100)

2.4 大鼠胰腺组织TLR4、 MYD88、 IRAK-2、IRAK-4 基因表达

如图3 所示,与假手术组比较,AP 模型观察组大鼠TLR4、MYD88、IRAK-2、IRAK-4 基因表达显著升高,组间差异具有统计学意义(P＜0.05);与AP模型观察组比较,奥曲肽阳性对照组及大黄牡丹汤高、中、低剂量组大鼠TLR4、MYD88、IRAK-2、IRAK-4 基因表达均有下降趋势,其中以大黄牡丹汤高剂量组显著,组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 大鼠胰腺组织TLR4、MYD88 蛋白表达

如图4、5 所示,与假手术组比较,AP 模型观察组大鼠TLR4、MYD88 蛋白表达显著升高,组间差异具有统计学意义(P＜0.05);与AP 模型观察组比较,奥曲肽阳性对照组及大黄牡丹汤高、中、低剂量组大鼠TLR4、MYD88 蛋白表达均有下降趋势,其中以大黄牡丹汤高剂量组显著,组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.6 大鼠胰腺组织IRAK-2、IRAK-4 蛋白表达

图3 大黄牡丹汤对TLR4、MYD88、IRAK-2、IRAK-4 基因表达的影响Figure 3 Effect of Dahuang Mudan Decoction on TLR4/MYD88/IRAK-2/IRAK-4 gene expression

图4 胰腺组织TLR4、MYD88 蛋白电泳图Figure 4 Electrophoresis of TLR4 and MYD88 protein in pancreas

图5 大黄牡丹汤对TLR4、MYD88 蛋白表达的影响Figure 5 Effect of Dahuang Mudan Decoction on the expression of TLR4 and MYD88

如图6 所示,光镜下观察,可以明显看到组织形态的改变,黄染颗粒为阳性染色,主要表达于胞核、胞质中;各组的IOD 值,与假手术组比较,AP 模型观察组大鼠IRAK-2、IRAK-4 蛋白表达显著升高,组间差异有统计学意义(P＜0.05);与AP 模型观察组比较,奥曲肽阳性对照组及大黄牡丹汤高、中、低剂量组大鼠IRAK-2、IRAK-4 蛋白表达均有下降趋势,其中尤以大黄牡丹汤高剂量组显著,组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.7 大鼠胰腺组织IL-2、iNOS、IFN-γ 含量

如图7,与假手术组比,AP 模型观察组大鼠IL-2、iNOS、IFN-γ 含量显著升高,组间差异具有统计学意义(P＜0.05);与AP 模型观察组比,奥曲肽阳性对照组及大黄牡丹汤高、中、低剂量组大鼠IL-2、iNOS、IFN-γ 均有下降趋势,其中尤以大黄牡丹汤高剂量组显著,组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图6 大黄牡丹汤对IRAK-2、IRAK-4 蛋白表达的影响Note. A, B. Effect on IRAK-2 protein expression. C, D. Effect on IRAK-4 protein expression.Figure 6 Effect of Dahuang Mudan Decoction on IOD of IRAK-2/IRAK-4 protein expression

图7 大黄牡丹汤对炎症因子含量的影响Figure 7 Effect of Dahuang Mudan Decoction on the content of inflammatory factors

3 讨论

急性胰腺炎作为临床上比较多见的急腹症,其发病原因较多,常导致胰酶在胰腺内被异常激活出现胰腺组织的自身消化、水肿、出血甚至坏死的局部严重炎症反应,如进一步发展可引发全身炎性反应并伴随全身多脏器损伤,引发死亡风险[12-13]。中医理论认为该病病情重,病势急,属毒热蕴结肠道,气血瘀滞不通之症,治当泄热散结,荡涤瘀滞。大黄牡丹汤出自汉代张仲景《金匮要略·疮痈肠痈浸淫病脉证并治》,该方以大黄、丹皮为君药,荡涤肠腑湿热瘀结之毒,以芒硝、桃仁为臣药,泄积热、下瘀血、除蓄结,冬瓜子为使药,破溃脓血,消除腹内积聚以助君臣之用,全方共奏泄热逐瘀之功,以消肠腑之瘀热。大量研究表明该方不但临床治疗AP患者疗效显著,而且能够有效改善急性胰腺炎模型大鼠肝肾功能损伤,降低炎性因子水平,促进胰腺组织修复[14-15]。

大黄牡丹汤方中大黄的主要成分为蒽醌类大黄素、大黄酸[16],刘涛等[7]使用大黄素干预非酒精性脂肪肝大鼠模型,发现能够抑制大鼠肝内TLR4、MYD88 的表达。曾丹等[17]使用臭氧应激的方法建立气道炎症小鼠模型,在使用大黄素进行治疗后也发现肺组织中TLR4、MyD88 表达明显下降,通过该通路发挥抗炎作用。Zhuang 等[18]、Bi 等[19]的实验研究则表明大黄素能够显著降低TLR4 的表达。牡丹皮中主要成分为芍药苷和丹皮酚[20],芍药苷是一种生物活性单萜糖苷,具有抗氧化、抗炎和抗高血糖的特性,Li 等[21]通过研究发现芍药苷可以通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB 途径减轻动脉粥样硬化炎症。张立才[22]的研究也表明芍药苷在脊髓损伤大鼠模型中能够通过TLR4/MYD88 炎症通路减轻大鼠的脊髓损伤。丹皮酚具有止痛,解热和抗过敏作用,Wang 等[23]研究表明丹皮酚通过调节TLR4 /MyD88 信号通路对LPS 诱导的急性肺损伤小鼠模型起到保护作用。He 等[24]评估丹皮酚在LPS 激活的小鼠N9 小胶质细胞中的抗炎作用,发现丹皮酚显著降低了TLR4/MyD88/IRAK4/TNFR 相关因子的表达,表明丹皮酚在相关信号传导途径起到了抑制炎症反应的作用。桃仁水煎物有抗炎、抗菌作用,已通过小鼠实验证明可分离出对急性炎症有显著抑制作用的蛋白质F、蛋白质G、蛋白质B[25]。周玉等[26-27]使用桃仁对糖尿病大血管纤维化大鼠进行干预,发现桃仁干预能够降低TLR4 的表达。兰涛等[28]研究桃仁提取物对急性胰腺炎大鼠肠道黏膜屏障功能及免疫功能的影响,同样发现中剂量和高剂量组小肠组织中TLR4 较低剂量组大鼠显著降低。冬瓜子基础化学成分包括氨基酸、无机元素及脂肪酸,刘静[29]通过研究冬瓜子水提取物、冬瓜子醇提取物、冬瓜子油对大鼠实验性慢性细菌性前列腺炎的治疗作用,发现三种提取物均能显著降低TNF-α、IL-6 炎症细胞因子。芒硝主要成份是含水硫酸钠,内服后在肠道内形成高渗盐溶液,吸附大量水分使肠道扩张,引起机械刺激,促进肠蠕动,从而发生排便效应,在急性胰腺炎的临床治疗中有明显效果[30-31]。上述文献均提示本研究中使用的大黄牡丹汤方剂主要组分在调控TLR4 和MyD88 表达以及炎症反应中发挥了重要作用。

TLR4 是TLR 家族的重要成员之一,广泛分布于胰腺细胞表面,能被感染、缺血、应激损伤等有害刺激激活,并进一步介导细胞内MyD88 结合丝氨酸/苏氨酸激酶、IRAK-2 和IRAK-4 形成复合物,进而启动蛋白质-蛋白质相互作用的级联反应,产生促炎性细胞因子和干扰素,启动炎症和免疫反应[32-35]。大量研究表明抑制TLR4/MYD88 信号通路的表达可以显著改善炎性反应的发生[36-37],而且已经有实验表明急性胰腺炎大鼠模型胰腺组织内TLR4/MYD88 信号通路显著激活并介导下游炎性反应,而药物干预有效下调胰腺组织内TLR4/MYD88 信号通路关键蛋白表达以及炎性因子含量,这与胰腺组织损伤的改善呈一致性[38]。

本实验结果显示,与假手术组比较,AP 模型观察组大鼠胰腺组织中TLR4、MYD88、IRAK-2 以及IRAK-4 基因蛋白表达以及下游炎性因子(IL-2、iNOS、IFN-γ)含量显著升高(P＜0.05),这可能是急性胰腺炎早期超强炎症反应发生的重要因素之一。与AP 模型观察组相比,治疗组大鼠胰腺组织中TLR4、MYD88、IRAK-2 以及IRAK-4 基因蛋白表达以及下游炎性因子(IL-2、iNOS、IFN-γ)含量不同程度降低,其中尤以大黄牡丹汤高剂量组改善最为显著(P＜0.05)。本研究认为,大黄牡丹汤有效改善大鼠胰腺组织损伤,减轻炎症反应的机制可能抑制TLR4/MYD88 信号通路有关,为大黄牡丹汤改善急性胰腺炎作用机制的研究提供了理论和实验依据。本研究只是初步探讨了大黄牡丹汤治疗急性胰腺炎的可能机制,具体有效成分及具体分子作用机制仍需要进一步研究。