对乙酰氨基酚所致急性肝损伤防治的研究进展

陈建彤，卢露，金之怡，南燕，应磊，汪洋

1.温州医科大学 病理生理学教研室，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童急危重症医学科，浙江 温州 325027；3.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 新生儿科， 浙江 温州 325027

对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）作为一种解热镇痛药物自1955年使用以来一直占据主导地位[1]。治疗剂量下的APAP具有很好的疗效，但一旦摄入过量就会造成肝毒性。成人APAP的推荐剂量为650～1 000 mg/4～6 h，不超过4 g/d。儿童剂量为15 mg/（kg·6 h），最高60 mg/（kg·d）。毒性产生剂量为7.5～10 g/d（成人）、140 mg/kg（儿童）[2]。APAP是引起药物性急性肝损伤最常见的药物之一，并成为欧美等发达国家引起急性肝衰竭的最主要因素[3]。研究表明，线粒体氧化应激是APAP所致肝损伤（APAP-induced liver injury，AILI）的主要细胞事件。据此，N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）被用作治疗AILI早期的一种有效解毒剂。然而，狭窄的治疗窗口以及不良反应限制了它的使用。目前，除了线粒体氧化应激外，还有许多其他的细胞过程参与了AILI的发病，包括I相/II相代谢、无菌性炎症、内质网应激、自噬、微循环功能障碍等。这些过程为更有效地治疗AILI提供了新的靶点。笔者综述了APAP肝毒性涉及的各种细胞事件以及针对这些事件可能的治疗措施，有望为AILI或者相关急性肝损伤的治疗提供新的思路。

1 以APAP肝脏代谢机制为靶点的治疗

药物在肝脏中代谢一般分为两个阶段。第一阶段称为I相反应，主要通过氧化、还原及水解反应，产生一系列包括氧自由基在内的肝细胞毒性产物；第二阶段称为II相反应，主要通过结合反应来解毒。APAP的代谢主要发生在肝微粒体内。大部分（约90%）APAP都进入了II相代谢途径，在II相代谢过程中，UDP-葡萄糖醛基转移酶和磺基转移酶催化APAP生成无毒性的葡萄糖醛基化和硫酸化的代谢物，这些代谢物通过尿液被排出体外[4]。极少量的APAP（约2%）在没有任何代谢的情况下随尿液排出。APAP的另一部分（约10%）被肝细胞色素P450酶系统的 CYP2E1转移到I相氧化，在此过程中形成了一种高度活性的毒性代谢物N-乙酰-对苯醌亚胺（N-acetylp-benzoquinoneimine，NAPQI）。APAP肝毒性从生成毒性代谢产物NAPQI开始，治疗剂量下的NAPQI通过与肝脏中大量的谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合丧失活性[5]。除此之外，NAPQI还可以直接修饰胞浆的肿瘤抑制因子kelch样ECH相关蛋白1（kelchlike ECH associated protein 1，Keap1）的半胱氨酸巯基，使Nrf2脱泛素化与Keap1分离，激活Keap1-Nrf2通路，调控抗氧化酶来促进APAP的代谢失活[6]。一旦过量使用APAP，NAPQI大量蓄积，导致肝脏内的GSH迅速消耗。此外，Keap1-Nrf2的生理性调控也将丧失，游离的活性NAPQI与蛋白质巯基发生反应，形成蛋白加合物。NAPQI蛋白加合物形成的主要靶点是线粒体，这将导致线粒体发生DNA损伤[7]。

APAP的药物代谢研究发现，增加APAP的II相代谢酶活性可以减少由细胞色素P450代谢产生的NAPQI，这有利于减轻APAP的肝毒性。有研究表明，通过激活肝X受体（liver X receptors，LXR）可以显著改善AILI，而这种改善作用主要是通过增强II相代谢酶活性来实现的[8]。除了增加II相代谢酶活性之外，还可以通过调节细胞色素P450酶的表达和活性来减轻APAP肝毒性。植物珠子草提取物能通过抑制CYP2E1的表达和活性来治疗小鼠的APAP肝毒性[9]， 绿茶提取物也已被证明能抑制CYP1A2和CYP2E1的活性来保护小鼠免受APAP肝毒性[10]。相关研究还表明，一些核受体和转录因子能调控这些酶的表达，如孕烷X受体（pregnane X receptor，PXR）[11]。对PXR基因敲除小鼠的研究发现其对APAP肝毒性的敏感性降低，这说明PXR主要是对CYP酶系统起到正向 调节作用[12]。此外，5-脂氧合酶（5-Lipoxygenase，5-LO）遗传缺失的小鼠APAP肝毒性也明显减轻，这主要与抑制其代谢酶CYP3A有关[13]。

虽然这些药物具有一定的治疗效果，但由于AILI患者往往在病程中已处于肝损伤阶段，来不及进行早期医学干预。因此，更有针对性的治疗方法，相较代谢阶段的预防性干预将更具临床意义。

2 以线粒体氧化应激和功能障碍为靶点的治疗

在APAP肝毒性的过程中，线粒体蛋白例如ATP合酶和谷胱甘肽过氧化物酶等都是毒性产物NAPQI结合的靶点。此外，NAPQI还能通过干扰线粒体电子传递链上的复合体I和II，导致电子泄露形成超氧自由基[14]。超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase，SOD2）通常会清除线粒体内的超氧化物，研究表明在部分缺乏SOD2的小鼠中，其肝脏损伤显著加重[15]。线粒体内过高的超氧化物除了可以分解为H2O2之外，也可以与线粒体内的NO反应产生高反应性过氧亚硝酸盐[16]。虽然GSH可以有效清除这些过氧亚硝酸盐，但当暴露于过量APAP环境中使GSH耗竭，就会导致线粒体酪氨酸硝基化。这些硝基化的线粒体蛋白造成了线粒体的DNA损伤以及线粒体通透性孔的开放，最终引起细胞坏死[17]。

目前，临床上有关APAP肝毒性的治疗措施主要是针对其线粒体氧化应激机制的。NAC作为一种抗氧化还原剂，是临床上使用的唯一解毒剂。其治疗原理是通过补充体内的GSH来改善氧化应激，以达到缓解急性肝损伤的目的。但NAC治疗窗口期狭窄，需要在APAP中毒后8 h内使用才具有较好的治疗效果，且还有恶心、呕吐、过敏等不良反应[18]。因此，除NAC以外保护线粒体的其他化合物可能是更好的选择。有报道称线粒体靶向抗氧化剂在APAP治疗后3 h也能预防AILI，这表明它是APAP中毒晚期患者的一种潜在的治疗选择[19]。另一种在APAP模型中被证明具有肝保护特性的现有药物是亚甲基蓝，这是一种临床使用的解毒剂，可以通过线粒体膜渗透。该药物可作为受损复合物II的电子载体，有效恢复ETC功能，维持线粒体生物能稳态，从而保护小鼠免受AILI的侵害[20]。

3 以信号通路为靶点的治疗

3.1 JNK通路 APAP诱导的线粒体氧化/硝基化应激的一个早期结果是胞浆中JNK的激活。大量的NAPQI积累耗竭了肝内的GSH，导致线粒体向细胞质释放更多的超氧化物，氧化线粒体内的硫氧还蛋白，使凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）与其脱离[21]，从而触发ASK-1的自我激活[22-23]。除了氧化硫氧还蛋白，线粒体氧化应激还能激活糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）。磷酸化的GSK-3β又进一步激活了混合谱系酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）。激活的ASK1和MLK3活化了蛋白激酶4/7[24]，然后激活JNK继而启动了级联效应[21]。通过转位到线粒体，与线粒体膜上Sab蛋白结合[25]，继而引起线粒体内Src的失活，最终导致电子传递链功能障碍，ROS释放增加。ROS继续激活上游丝裂原活化蛋白激酶，然后磷酸化JNK，JNK的持续激活又可以扩增线粒体ROS，形成了一个自我维持的激活回路[26]。在活化的JNK向线粒体转移的同时，也引起胞浆内Bax的激活并转位到线粒体，触发了线粒体通透性转变孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的开启，导致膜电位的缺失和ATP的耗竭[27]。MPTP的诱导最终会导致大量重要的线粒体蛋白释放到胞浆中，例如凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）和核酸内切酶G。这两种蛋白都移位到细胞核中，导致DNA断裂，最终引起细胞坏死[28]。

SP600125是JNK一种经典的ATP竞争抑制剂，已被报道在体内和体外对AILI具有保护作用。此外，在AILI患者中延迟给药5 h比NAC更有效[29]。另一种已被证明可以预防APAP肝毒性的JNK抑制剂是DJNKI1，它是一种抑制JNK与基质相互作用的肽。考虑到JNK在肝再生中的功能和其他可能的保护作用，直接或间接抑制JNK的策略也可能抑制JNK的潜在益处，这可能限制JNK抑制剂的治疗应用[30]。最近，从樟脑草中分离到的萜烯化合物也被证明能通过抑制磷酸化JNK与线粒体蛋白Sab的相互作用来保护免受APAP肝毒性[31]。该药在未来的临床应用中可能非常有前景，因为它是干扰了JNK的自维持激活回路，而不是直接抑制JNK，因此不会抑制AILI中瞬态JNK激活可能产生的有益作用[32]。二甲双胍也被证明能通过上调Gadd45基因表达抑制磷酸化JNK来保护和治疗AILI[33]。但后续研究又发现，二甲双胍治疗APAP肝毒性并不是抑制JNK激活或线粒体转位，这说明可能存在别的信号通路或细胞事件参与了保护作用[34]。

3.2 Nrf2通路 在APAP肝毒性的过程中，毒性代谢产物NAPQI的直接修饰作用以及线粒体氧化应激共同激活Keap1-Nrf2信号通路。Nrf2的激活导致血红素氧酶-1（heme oxygense-1，HO-1）等抗氧化酶的转录激活，催化GSH合成来促进APAP的代谢失活，从而抵御NAPQI所导致的肝脏毒性。

有研究表明，除了直接被NAPQI激活外，蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）也参与了Keap1-Nrf2通路的激活[35]。在缺乏PTP1B或M1毒蕈碱受体（M1 muscarinic receptors，M1R）的小鼠中，成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）和M1R 能保护其免受APAP肝毒性。这种保护作用主要是通过增强肝脏中的Nrf2信号通路来实现的[36]，提示PTP1B和M1R可能是对抗AILI的新的治疗靶点。除了FGF21和M1R，许多生物活性成分也可以通过进一步激活Keap1-Nrf2通路来保护APAP诱导的肝毒性，例如丹参酮IIA、香椿槲皮素、咖啡酸、鼠尾草酸 等[16]。虽然这些天然产物对APAP肝毒性的影响通过预处理法进行了检测，但是由于APAP肝毒性的不可预测性，需要进一步研究来确定其临床疗效。

4 以无菌性炎症为靶点的治疗

APAP肝毒性导致肝细胞内容物的大量释放，包括核DNA片段、线粒体DNA和ATP等。这些细胞损伤相关分子（cell injury related molecules，CIRM）可以激活枯否细胞（Kupffer cell，KC），诱导其释放促炎性细胞因子[37]，随后将中性粒细胞和单核细胞招募到肝脏的损伤区域[38]。持续和放大的炎症反应，最终导致氧化应激和过氧化亚硝酸盐形成，促进肝损伤[37]。同时，激活的KC也能释放细胞因子IL-4和抗炎因子IL-10通过清除细胞碎片和促进细胞再生来发挥保护作用。在APAP的肝毒性期间，通常会引起广泛的无菌性炎症。然而，它究竟是促进肝损伤的进展，还是作为细胞对毒性的防御仍然有很大争议[39]。尽管如此，无菌性炎症仍可能作为一种治疗靶点来保护APAP的肝毒性。

有研究表明，TNF I型受体基因敲除小鼠能保护其免受APAP肝毒性，这可能与致炎细胞因子TNF-α和IL-1的产生减少有关[40]。苯乙醇也被证明能以toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）依赖方式减少IL-1和IL-18的释放，由此来预防AILI[41]。然而，该药物的线粒体毒性作用限制了其在临床的使用[42]。脂氧素A4同样也被证明能对APAP肝毒性起到一定的保护作用，其主要机制是通过抑制炎性调节因子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活化来减少促炎因子TNF的表达[43]。除了抑制促炎因子的释放，阻止中性粒细胞的招募也是一种可行的治疗手段。据报道，消退素能通过抑制中性粒细胞进入肝脏而减轻APAP的肝毒性[44]。炎症除了可能促进AILI的进展外，还有助于清除死细胞和碎片，刺激肝脏的后期修复和再生，因此，对再生后期治疗效果的研究也必不可少。研究表明，IL-6可以通过激活磷酸肌醇3激酶和Akt来促进再生和诱导保护性热休克蛋白的表达[45]。据报道，野生型小鼠中IL-6及其家族成员IL-11、白血病抑制因子的肝脏mRNA表达呈时间依赖性增高，提示该细胞家族可能对肝脏具有保护作用。研究也证明IL-6在敲除小鼠中更容易加重AILI，而这种APAP肝毒性易感性的增加与APAP治疗后肝热休克蛋白25、32和40的表达缺乏有关。这些结果表明，IL-6和其他家族成员可能通过上调肝脏中几种细胞保护热休克蛋白的表达来保护肝脏免受损伤[46]。乳铁蛋白是一种多功能蛋白，可以调节免疫细胞功能。研究已证明乳铁蛋白可以通过调节炎症反应来实现对APAP肝毒性的保护作用。与此同时，研究也发现乳铁蛋白还可以通过激活KC抑制APAP诱导的肝窦内皮细胞损伤，改善肝微循环功能障碍[47]。总而言之，由于炎症在APAP肝毒性的确切作用尚不明晰，所以将其作为治疗靶点也存在争议。

5 以内质网应激为靶点的治疗

内质网应激是另一种应激通路，可诱导JNK通过细胞凋亡介导细胞死亡[48]。内质网应激可在各种肝损伤模型中观察到，在APAP肝毒性中也发挥了一定的作用。在APAP肝毒性过程中，这种应激反应是由NAPQI与ER蛋白共价结合触发[49]。大量积累的NAPQI耗竭内质网中的GSH，也可能会引起氧化还原失衡，导致eIF2α侧蛋白的磷酸化以及活化转录因子6（activating transcription factor，ATF6）和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的激活[50]。研究发现，CHOP在一定程度上能促进AILI的发生[51]。有报道称，辛伐他汀能通过抑制CHOP的表达对小鼠AILI产生保护作用[52]。盐酸奥扎格雷被证明能通过抑制CHOP的表达来减少肝细胞死亡[53]。

S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）也被证明可以通过减少eIF2α磷酸化，抑制CHOP上调及其核易位，取消caspase 3的活化，最终保护肝细胞免于凋亡[54]。因此，抑制CHOP可能是治疗APAP中毒患者的一种潜在治疗策略。此外，也有研究发现，功能性鞘氨醇-1-磷酸（S1P）受体拮抗剂FTY720和鞘氨醇激酶-1（SPHK1）抑制剂PF543均能通过减少eIF2α的磷酸化以及激活转录因子4（ATF4）的水平以减轻APAP诱导的ER应激，并显著改善AILI[55]。

6 以自噬为靶点的治疗

自噬是细胞自身一种严格调控的过程，它通过去除不需要的胞质内容物和受损细胞器来更新细 胞[56]。自噬开始于双膜结构的吞噬体，随着吞噬体的膨胀和闭合，吞噬体成为一个完整的自噬体，然后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体[57]。受损线粒体和内质网应激引起的ROS可诱导自噬。APAP肝毒性可以引起线粒体损伤、ATP消耗和肝细胞内APAP蛋白加合物的积累，最终导致肝细胞坏死[58]。自噬有助于清除损伤的线粒体，并为ATP的产生提供能量，因此可以推测自噬可能是对抗APAP肝毒性的重要保护机制。有研究表明：脂联素可以通过激活AMPK和ULK1介导的自噬来预防AILI[59]。雷帕霉素也被证明能通过诱导自噬来减轻AILI[60-61]。此外，小豆蔻素也被报道通过激活NFE2L2信号通路促进自噬，产生对AILI的保护作用[62]。最近的研究还发现，水果和蔬菜等天然产品中提取的非瑟酮通过增加ATG5的表达促进自噬，从而抑制AILI[63]。这说明诱导自噬可能可以作为一种潜在的治疗方法来减轻APAP肝毒性。然而，自噬在机体调节中除了是细胞应激下的一种生存机制外，在一定条件下还可以诱导自噬细胞死亡。高水平的自噬细胞可去除细胞内过多的脂质，并损害正常的细胞器，导致膜通透性增加和线粒体损伤，最终导致自噬细胞死亡[64]。 因此，由于自噬的双重作用，通过诱导自噬来作为减轻APAP肝毒性的潜在治疗策略仍有待进一步确认。

7 以微循环功能障碍为靶点的治疗

除了通过APAP的代谢激活直接导致肝细胞损伤外，肝脏微循环障碍也参与了AILI。肝坏死前的微血管充血提示APAP不仅对肝细胞有毒性，而且对肝窦状内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）也有毒性，而LSECs是APAP对肝脏损伤的早期靶点。研究已经表明：APAP通过显著降低小鼠分离的LSECs的GSH水平而具有毒性。APAP对LSECs的损伤也反映在处理后的细胞质中出现较大的缝隙[65]。这些结果充分证明了肝脏微循环障碍在APAP肝毒性中的重要作用。NO通过影响白细胞、血小板和内皮细胞黏附分子的表达，在维持肝脏微血管的充足血液供应方面发挥着关键作用。NOS抑制剂加剧了肝脏微血管炎症反应，包括白细胞-内皮相互作用于内毒素和缺血再灌注，提示NO对稳定肝脏微循环具有保护作用。ITO等[66]的研究证明，NOS亚型衍生的NO能通过稳定肝脏微循环发挥对APAP肝毒性的保护作用。GANEY等[67]研究发现，LSECs在APAP过量后比肝细胞更早出现损伤，而这些损伤的LSECs激活了凝血级联反应使得血小板数目减少，随后通过激活蛋白酶激活受体-1（protease activated receptor-1，PAR-1）信号通路造成凝血系统的紊乱并最终形成了AILI。研究表明，使用肝素的抗凝作用能在早期（6 h）缓解其肝毒性[67]，同为抗凝剂的达比加群酯也能降低早期APAP的肝毒性，但由于肝细胞的增殖减弱，其在APAP后24 h又显著加重了肝损伤[68]。因此，抗凝治疗还存在着一定的不确定性，需要后续深入研究。

8 总结与展望

随着APAP在临床上的广泛使用，其肝毒性问题逐渐成为重大的公共卫生问题。临床上主要使用NAC来作为唯一解毒剂，通过缓解氧化应激发挥作用。但由于NAC使用的局限性，使得寻找新的有效治疗药物成为当务之急。AILI机制十分复杂，许多细胞内外事件都参与了这一病理生理过程，包括代谢、线粒体氧化应激和功能障碍、无菌性炎症、内质网应激、自噬、微循环功能障碍等，这些事件调节AILI的各个方面，如启动损伤，直接介导肝细胞死亡，限制细胞应激反应，帮助肝脏修复和再生。因此，除了氧化应激之外，其他过程也可能是AILI的潜在治疗靶点。目前的研究发现，以代谢机制为靶点的治疗能对APAP肝毒性起到早期的干预，但这些可能用作临床解毒剂的化合物还需要在APAP后进行测试，而不单单只作为预处理。未来的临床研究可能还需要更进一步探索这些药物的后期治疗效果和潜在的不良反应。针对内质网应激和微循环障碍的治疗也能在一定程度上保护APAP肝毒性，但后续的临床研究需要进一步明确其保护机制。值得注意的是，无菌性炎症和自噬在AILI的不同阶段发挥不同的作用，使得它们在调节APAP肝毒性方面具有矛盾性，针对这些事件的治疗策略可能最终无效。总而言之，未来我们需要进行更多的研究来进一步阐明这些时间依赖性事件在AILI中的确切作用，从而使得后期治疗在临床中成为可能。