肠道菌群样本的收集、储存、检测

问 馨，王宏刚，杨晓钟

南京医科大学附属淮安第一医院消化内科，江苏 淮安 223300

肠道菌群不仅与人类的健康息息相关，还与许多疾病有关，包括炎症性肠病[1]、结肠癌[2]、脂肪肝[3]等消化系统疾病以及代谢综合征[4]、帕金森病[5]等非消化系统疾病。这些疾病可以归纳为肠道菌群失调相关疾病。这个概念虽不能反映疾病的整体特征，但从肠道菌群研究的角度来看，这类疾病的共有特征是肠道菌群失调。肠道菌群失调与疾病的因果关系是近年来的研究热点。研究肠道菌群最为基础的是获取菌群样本以进行分析。样本的检测分析技术在一定程度上影响了研究结果的准确性。随着高通量扩增子测序、宏基因组学、转录组学、代谢组学的快速发展，肠道菌群的研究进一步推动了研究成果的临床转化。重视样本的收集、储存、检测，有利于研究结果的准确性和可比性。

1 样本收集

人类肠道中存在多种微生物，包括细菌、古菌、真菌、病毒，被称为肠道微生物群。肠道微生物群在每个个体中都是独一无二的，大多数(约80%)随着时间的推移保持稳定[6]。肠道微生物群主要由细菌组成，病毒和真菌只占了其中很小的一部分。因此，对肠道微生物群的研究，主要集中于肠道菌群。健康人体的肠道菌群处于动态变化之中，且同一个体的具体菌株都有很大的变化[7]。但体内菌群的波动幅度与个体间菌群的差异相比，可以说是微乎甚微。肠道菌群的动态变化参与了人体的生长发育[8]、代谢食物[9]、调节免疫[10]等重要生理功能。

研究肠道菌群可通过粪便、直肠拭子、肠黏膜、肠灌洗液等方式获取样本。粪便是很容易获取的研究样本，但粪便菌群不等于肠道菌群。粪便不能准确地反映小肠和近端结肠的菌群，尤其是附着于肠黏膜的菌群。肠黏膜菌群也是肠道菌群的一部分，更能反映肠道病变部位的菌群变化，但需内镜下活检取材肠黏膜，对肠道有些许损伤。肠黏膜菌群与遗传因素有一定关联，而粪便菌群受环境影响更显著[11]。因此，利用粪便样本难以对疾病部位的菌群进行分析[12]。动物研究发现，粪便菌群与肠黏膜菌群可能存在很大差异[13]。但动物肠道内的菌群与人类肠道内的菌群也有很大的差异[14]。直肠拭子是检测远端肠道菌群组成的另一种方式。相比粪便样本，直肠拭子简化了样本收集和DNA提取的过程，但在菌群组成方面两者很类似[15]。有研究[16]发现，结肠灌洗样本在一定程度上反映了结肠活检样本菌群的组成。

经内镜肠道植管术(transendoscopic enteral tubing，TET)是获取肠内容物样本的一个好方法。结肠途径TET是指在内镜辅助下植入细管并固定于回盲部，体外端沿肠道与外界相通，可长时间保留于肠道内[17]，为肠道深部给药和肠道样本的动态获取提供了新的方法[18]。TET管可以实现每天多次取样，研究回盲部菌群及与昼夜节律的关系[18]。另外，不同肠道节段的菌群也存在差异[19]。我们建议在做肠道菌群研究时，需考虑菌群样本的来源，包括宿主种属(人或动物)、样本类型(粪便或肠黏膜)、取材部位(小肠或结直肠)等。保持样本来源的均一性，有助于降低样本间的干扰因素，提高可比性。

2 样本储存

获取的样本需在短时间内转运和储存。Budree等[20]认为粪便处理时间在3 h左右不会影响粪便菌群，但转运时间过长易导致粪便菌群发生改变[21]。研究者发明了GutAlive一次性粪便采集试剂盒，用于粪便采样和运输，以确保包括厌氧菌在内的粪便菌群的活力[22]。国内也有多家医疗器械公司发明了菌群采样器和样本保存液，可常温保存1周以上，保护粪便菌群DNA完整性，为菌群测序分析提供稳定的样本。常用的样本储存方法包括直接冻存和添加保护液(乙醇或RNA保护液)等。Vogtmann等[23]研究发现，粪便不适合储存在70%的乙醇中，而95%乙醇可以充分保存粪便样本。RNA保护液可以防止粪便样本的RNA降解，但处理后的样本难以进行后续的代谢组学检测。目前公认的样品储存方法是冻存于-80 ℃冰箱[24]。在无保护液的情况下，粪便菌群在-20 ℃或4 ℃储存8周内变化均很小。如果在4 ℃储存时间较长，可能会导致样本中的真菌生长[15]。但总体而言，个体间的菌群差异远超样品储存过程中的变化。因此，我们建议收集新鲜的粪便在-80 ℃快速冷冻作为最佳的储存条件。如果在条件允许的情况下，可以考虑使用试剂盒对粪便样本进行储存。

3 样本检测

3.1 细菌培养对于已知培养条件的细菌，细菌培养仍是最敏感的检测方法，可用于确定生长条件显微镜观察和耐药性检测[25]。人类肠道中85%以上的细菌是厌氧菌，因此需在严格厌氧条件下进行培养[26]。样本收集与处理的时间间隔对于细菌培养非常重要，建议尽量缩短样本处理的时间[27]。虽然细菌培养方法已有很多进步，但还是难以明确粪便中的哪些菌群可被培养，因为任何培养条件均无法满足细菌种类繁多的菌群样本的培养要求[28]。另外，由于样本易被污染，细菌培养结果容易产生偏差。

3.2 扩增子分析对肠道菌群的认识是从扩增子高通量测序开始的，这是目前常用的肠道菌群检测方法。扩增子分析的方法是对特定长度的PCR产物或捕获的基因片段进行测序，如原核生物16S rRNA，真核生物18S rRNA或rDNA ITS。几乎所有的细菌均有16S rRNA，它是一个高度保守的基因，常以多基因家族或操纵子的形式存在[29]。这些特定的遗传物质包括进化保守性及进化可变区，因此通过对可变区的测序分析，弥补细菌培养的缺点，获得无法分离培养的物种信息，从而对样本中菌群多样性进行全面的研究。扩增子分析适合大规模样本分析，但该方法受样品收集和处理存在差异，难以建立通用的扩增引物，分析方法不够全面等因素的限制，无法准确地反映样品中菌群的结构[30]。

3.3 宏基因组学随着测序技术的进步和费用的降低，越来越多的研究者采用宏基因组分析肠道菌群的分类和功能研究。与16S rRNA扩增子分析不同，宏基因组还可用于研究样本中真菌和病毒[31]。宏基因组测序可以评估任何菌群的全部基因组含量，实现精确的分类和准确的功能分配[25，32]。宏基因组学的局限性主要在于不能区分活细菌和死细菌[33]。现有的宏基因组数据可比性欠佳，原因在于缺乏含有效菌群分析参数的统计工具以及实验和数据处理中的人为偏差[34]。

3.4 转录组学转录组学是在宏基因组学之后兴起的一门新学科，适用于分析特定环境、特定时期在某功能状态下转录的所有RNA的类型及拷贝数。这种技术不但具有宏基因组的优点，还能反映群落的功能活性，所以它能够捕捉菌群的动态变化，从而对菌群整体进行各种相关功能的研究。转录组学能够直接对转录的活性基因进行检测，着力于研究菌群功能基因的表达，为分析菌群的关键功能基因指明新的道路。个体间可以有很大的肠道菌群差异，而菌群基因表达和代谢通路却是相对保守的，所以可以更显著地提示疾病状态，转录组差异可能更好地显示疾病相关的菌群变化[35]。相比于扩增子分析，转录组更能分析菌群的功能变化[36]。但粪便菌群的转录组稳定性可能差于宏基因组[37]。Schirmer等[38]研究炎症性肠病患者的转录组，发现很多菌群虽然基因组丰度不太突出，但可能因为转录组水平高而对疾病起到决定性作用。这提示炎症性肠病患者的菌群差异可能更多的在转录组层面。由此可见，转录组学比宏基因组学在某些疾病中有着特殊的优势。

3.5 代谢组学代谢组学是利用先进的分析化学技术来综合测量各种生物谱系中的代谢物，用于解释肠道菌群生物活性的机制[39]。例如，粪便pH试纸就可以用来粗略测量粪便中脂肪酸的含量和乳糖耐受情况。代谢组学不仅能够检测出菌群修饰或生物合成的分子，而且还可以直接判断影响肠道菌群的药物和食物[40]。我国古代已有通过观察粪便的颜色和闻气味来评估患者健康的记载。代谢组学最常用的方法是通过色谱法分离代谢物，然后作为带电离子进行质谱分析。质谱可以对肠道菌群的代谢物进行定量检测，灵敏度很高，甚至在含量很少的样本中也可以进行检测。最近，新型软电离生物质谱的发展加快了对大分子的快速检测，例如，MALDI Biotyper[41]是利用核糖体蛋白质组指纹图谱的方法来分析微生物，可以快速地对细菌、真菌、酵母菌进行分类，适用于大多数肠道菌群的鉴定。但质谱分析只能识别已知的菌群种类，加之检测成本较高，很大程度上限制了其临床应用。代谢组学与肠道菌群之间有密切的联系。血液代谢组学可以预测肠道菌群的多样性[42]，这提示各组学之间可能存在关联性。

各组学联合使用可以更全面地评估肠道菌群，在生理、病理、药理等方面具有重要意义[43]。但多种分析方法可能会产生不同的研究结果，这可能与样本的收集和储存，所使用的检测技术以及样本量不同有关。在不同的研究中，应注意选择适合肠道菌群图谱的技术方法。

4 讨论

随着对肠道菌群不断深入的研究，我们对菌群与疾病的认识已发生了从相关到因果的转变。未来，样本收集和储存的标准化以及多组学的联合分析，将进一步揭示肠道菌群研究在多学科疾病中的重要意义。肠道菌群失调相关疾病这个概念与多学科疾病整合观相吻合。包括洗涤菌群移植在内的重建肠道菌群的技术体系已成为这类疾病的前沿性治疗方法[44-45]。基于此，重视肠道菌群研究的样本收集、储存、检测，将进一步促进临床转化。