肠道微生物群-TLR4-肝轴参与肝细胞癌的发生发展

李建辉，聂 耶，毛珍珍，张天辰，雷鑫焌，王彦芳，宋文杰

1.西安医学院，陕西 西安 710021； 2.空军军医大学西京医院肝胆外科

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中85%～90%是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，在癌症相关死亡原因排第2位，在2018年全球HCC新增约84.1万例，与之相关的死亡约78.2万例，中国分别占约46.6万例和42.2万例[1-2]。肠道微生物群的稳态对人类的健康起关键作用，肠道微生物及其衍生物通过向宿主新陈代谢发出信号，连接宿主的免疫系统、内分泌系统、循环系统[3]，参与多种疾病的发生、发展。肝脏通过门脉系统与肠道相连，肝脏不仅接受肠道富含营养的血液，而且还是肠道微生物群的第一个靶点[4]。有关研究[5]表明，肝脏可通过Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)(TLR4发挥了核心作用)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)诱发肝脏产生炎性病变及纤维化，进而形成肝硬化，最终导致HCC发生。其中，肠道微生物群扮演着十分重要的角色。因此，通过改变或调整肝-肠循环轴，可以影响肝癌的发生、发展。

1 肠道微生物群与肠-肝轴

1.1 肠道微生物群肠道微环境中，约2 000种微生物，它们被称为肠道微生物群。除了古生菌、真菌、病毒外，肠道微生物群主要由5种菌门组成，即厚壁菌门(79.4%)(瘤胃球菌、梭状芽胞杆菌、真细菌)，拟杆菌门(16.9%)(卟啉单胞菌、普氏菌)，放线菌门(2.5%)(双歧杆菌),变形菌门(1%)，Verrumicrobia(0.1%)[6]。肠道微生物群在健康和疾病中扮演着不同的角色，可以在“共生”、“寄生”、“病原体”之间切换[7]。正常稳态的肠道微生物群有助于机体健康，确保新陈代谢，维持正常的肝脏功能。现已证明很多疾病的发生与肠道微生物群稳态失衡有关，如心血管疾病、炎症性疾病、糖尿病等[8]。研究证实，肠黏膜完整性是维持肠道微生物群稳态的重要因素，而肠黏膜完整性取决于肠上皮内表面的保护层，肠上皮细胞之间的连接蛋白和肠道内的免疫细胞的正常功能。

1.2 肠-肝轴“肠-肝轴”的概念由Marshall在1998年提出，即：肠道遭受打击后，肠屏障功能受损，肠道内细菌、内毒素大量进入门静脉系统，肝内的Kupffer细胞等被内毒素激活，释放一系列炎性因子，引起肝脏损伤；同时，损伤肝脏的Kupffer细胞吞噬能力下降，免疫蛋白合成减少，血流动力学发生改变，造成肠道功能受损。因此，肠-肝轴是胃肠道和肝脏之间通过解剖和功能双向相互作用的途径。

肝脏通过门静脉接收来自肠道约75%的血液，经胃肠道消化吸收的营养物质经门脉系统进入肝脏，肝脏分泌的胆汁通过肠肝循环进行代谢，胆汁酸的生理变化有助于改善肠道屏障功能，对肠-肝轴起正向调节作用[3]。肠道内皮细胞损伤引起肠壁通透性增加，导致肠内菌群经门静脉移位至肝脏，引起菌群代谢失调，产生内毒素(脂多糖)、细菌代谢物(肽聚糖)、细菌DNA等毒副产物，统称为PAMPs[7]。肝脏是革兰氏阴性菌主要成分内毒素的第一个过滤器，内毒素已被证明是全身炎症的主要驱动力，同时脂多糖能够通过与TLR4结合，引发炎症级联反应，释放细胞炎性因子，引起肝细胞的损伤[7]。肝脏慢性损伤导致清除脂多糖、细菌、代谢毒物能力下降，胆汁和胆汁酸分泌减少。

研究证明[5]，TLR4通过多种机制在肝癌的发生发展中发挥作用，包括增加Tregs和肝脏滤泡辅助样细胞的数量，增加促炎和恶性相关分子的产生。在慢性感染性和非感染性炎症疾病中，脂多糖通过激活TLR4引起肝脏的损伤和炎症的发生，进一步促进肿瘤的生长。门静脉可能是微生物群及毒副产物进入肝脏的通道，从而导致脂多糖激活肝癌细胞中的TLR4[9]。TLR4和肠道微生物群不是HCC启动所必需的，而是通过介导促进增殖及肝分裂原表观调节素的表达和防止细胞凋亡而促进HCC[10]。近年来，国内外大量研究证实，TLR4/LPS参与HCC的发生，如Liu等[9]发现，TLR4+细胞在体外具有较高的迁移和侵袭潜能，而TLR4在具有大血管侵犯的HCC组织中有较高的表达。通过16S rRNA测序对HCC患者肠道微生物群进行鉴定，肠道微生物参与了HCC的进展，其有望成为HCC早期诊断的潜在无创工具[11]。这些结果表明，肠道微生物群-脂多糖-TLR4-肝轴是一个潜在诊断及治疗HCC的分子靶点。

2 肠-肝轴在HCC发展中的作用

大多数HCC患者是肝脏长期慢性损伤、炎症、纤维化、肝硬化进展的结果。肠道微生物群与HCC的关系复杂，微生物群引起HCC的发生、发展主要是通过炎症途径驱动，这些途径是由肠道细菌、免疫系统、肝脏之间的串扰启动，其过程主要涉及了肝脏中巨噬细胞、Kupffer细胞、PAMPs之间的相互作用[3]。用无菌、肠道灭菌、脂多糖处理的小鼠进行功能实验，结果表明，DEN-CCL4在肠道灭菌和无菌小鼠中诱导的HCC发展被减弱；缓慢输注低剂量的脂多糖可促进小鼠HCC的发展，而抑制TLR4信号则可抑制小鼠HCC的形成[12]。炎性刺激诱导的炎性细胞因子同时又可抵消免疫监视，促进肿瘤生长与转移[13]。目前肠道微生物菌群失调引起HCC的发生、发展主要通过TLR4-MyD88-NF-κB通路和胆汁酸代谢两条途径。

由于TLR4参与PAMPs/损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)识别的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)可通过外源性途径激活HCC相关的炎症，因此被认为是诱发或刺激HCC发生发展的一个分子[5，14]。其原因可能是TLR4促进了适合癌细胞持续增殖的环境。TLR4通过TLR4-MyD88-NF-κB途径在肝肿瘤的发生、发展中起中心调节作用[15]。MyD88依赖的NF-κB途径和TRIF依赖的IRF-3途径在病原体相关固有成分的刺激下被激活，其中NF-κB通路在许多生物学活动的调控中尤为重要，如有丝分裂、基因表达、细胞凋亡、肿瘤发生等。脂多糖刺激TLR4可上调TLR4 mRNA和蛋白水平，诱导了TLR4与衔接分子MyD88相互作用，进而使下游的NF-κB信号通路激活，引起炎症介质的产生，促进HCC细胞的存活和增殖[16-17]。抑制TLR4-NF-κB信号使组蛋白相关趋化因子的产生受损，可抑制肝癌细胞的迁移和转移[18]。

肠道微生物菌群将肠道胆汁酸转化为非结合形式的能力是胃肠道代谢稳态的核心，这些非结合胆汁酸可以激活胆汁酸信号受体法尼醇X受体(Farnesoid X receptor，FXR)[19-20]。胆汁酸通过调节肠道微生物的生长和粘附，维持肠道微生物稳态，其肝细胞中的FXR具有抗炎和促进肝脏生成的作用。微生物菌群失调引起的炎症反应使FXR基因表达降低，使胆汁流量减少，导致肝脏损伤。FXR通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB通路，调节肠道微生物菌群失调产生的炎症而发挥抗炎症反应，而脂多糖通过TLR4-MyD88-NF-κB通路影响肠道通透性引起菌群失调，因此，FXR与TLR4信号之间的相互抑制可能是预防微生物菌群失调的重要机制[21]。同时FXR能诱导多种肿瘤抑制因子的基因表达，包括抑制小分子异源二聚体(small heterodimer partner，SHP)、E-钙黏蛋白、细胞因子信号传导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)[22]。在缺乏FXR的情况下，长期较高的胆汁酸水平导致细胞过度增殖、NF-κB激活、DNA氧化损伤，从而为HCC的发生奠定基础[23]。

研究表明，乙醇诱导缺乏FXR基因的小鼠更易引发全身炎症和HCC，且FXR+的小鼠肝细胞中NF-κB活性降低[24]。FXR激动剂可通过多种机制对肝脏的肿瘤产生抑制作用，其中一个重要的机制是干扰IL-6/Janus激酶(JAK)/STAT3信号通路的激活，该信号通路被发现在肿瘤的发生、发展中起着关键作用[25]。因炎症激活的NF-κB可转移到细胞核，编码促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达上调，而IL-6可以激活Janus激酶-STAT3(JAK-STAT3)通路，从而减少HCC细胞的凋亡和促进HCC的进展[26]。相反，FXR激动剂可有效抑制肝癌细胞系中NF-κB的激活和抑制STAT3磷酸化[23]，因此，稳定肠道菌群的平衡，降低炎症对FXR的抑制，可以作为抑制炎症驱动肝癌发生的一种策略。

3 肠道微生物群联合免疫治疗在HCC治疗中的作用

临床上通过粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)重建肠道菌群，成功救治了1例免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)相关性结肠炎的患者[27]，但肠道微生物菌群治疗HCC的机制研究尚未清楚。最近的研究表明，肠道微生物群在调节ICIs的治疗反应方面起重要作用[28]。将对免疫检查点阻断治疗有反应的癌症患者的粪便微生物群移植到无菌或抗生素治疗的小鼠身上，可以改善PD-1抑制剂的抗肿瘤效果，而来自无反应患者的FMT却不能做到这一点[29]。FMT可能通过重建肠道微生物群和改善胆汁酸代谢来调节抗肿瘤免疫治疗的效果[30]。在检查PD-1单抗治疗HCC患者的粪便微生物组成中，得出了4种乳酸杆菌及齿双歧杆菌和嗜热链球菌可以通过抑制病原菌的生长，增强宿主的免疫作用，临床通过让HCC患者口服双歧杆菌提高了PD-1单抗治疗的效果[31]。该试验也首次证实了肠道微生物组成的动态变化特征可用于在治疗开始后3～6周内预测未来6个月PD-1单抗治疗HCC的结果。因此，在未来的抗肿瘤治疗中，FMT可能成为一种有效的辅助手段。

4 展望

目前，关于肠道微生物群失衡引发HCC的作用机制、作用靶点仍未完全阐明。通过基因组测序对关键细菌属或种进行系统研究，并对靶向肠道微生物群的生物标志物进行研究，可能实现HCC的有效预防和早期无创诊断。在治疗方面，肠道微生物群、TLR4、FXR可能成为未来HCC辅助治疗的新兴靶点，通过对肠道微生物群的调节，应用抗TLR4单抗、FXR激动剂可能提高HCC的临床治疗效果，改善患者的长期预后。