纱网袋颜色对红雉凤仙花传粉者不同时间段访花行为的影响

钟楠蝶, 李登飞, 杨有芹, 魏丽君, 王琼*

1. 西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637000；

2. 西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637000；

3. 华中师范大学生命科学学院，湖北 武汉 430079

传粉过程是研究花部特征和传粉者关系的纽带，进而也为研究花部特征进化提供了契机[1]。传粉昆虫往往会对某一色系的花产生偏爱[2,3]，花色也成为植物吸引传粉者重要“广告特征”之一[4,5]。由于传粉者不能在距离花朵0.4 m以外分辨出是否有报酬，因此开花植物往往通过花色近距离吸引传粉者，即传粉者对颜色的偏好则在近距离内发生选择性作用[5]。盗蜜是指访花者直接在蜜距或是花冠上打洞，不进行授粉仅取食花蜜的行为，是影响植物与传粉者互利共生关系关键的生物因素之一[6,7]。在动植物的相互关系中，盗蜜被认为是一种不同于普通传粉者的不正常的访花行为，盗蜜者除了作为似盗蜜传粉的正效应之外，还可能改变对正常传粉者的访花行为[8]。一些研究结果显示，盗蜜对植物的结实可能不会产生影响，但也有可能会通过影响传粉者行为而影响传粉者介导的结实[9]。总之，盗蜜如何通过影响植物与传粉者的互利共生关系，最终影响植物的适合度与进化仍不明了。通过人工操纵法隔离盗蜜者作为对照，可针对性评价盗蜜的生态学后果，有利于更深入地研究多物种间的相互作用和协同进化。用纱网袋套住植物的花冠或蜜距隔离盗蜜者时，纱网袋颜色可能会干扰传粉者正常访问，因为传粉者往往偏爱某种颜色的花[2,3]。因而，筛选出一种对传粉者干扰最小的纱网袋颜色成为最急需解决的问题。研究盗蜜对传粉者访花行为的影响，若在传粉者访问的高峰时间段进行观测，效果更明显，因而传粉者一天中的访花节律也值得进一步探讨。研究发现，传粉者一天中的访问节律与环境因子以及植物的花部特征、花蜜产量等密切相关[10-12]，每个时间段的花蜜体积、糖浓度变化尤为明显[13]，这意味着传粉者在不同时间的访花频率存在一定差异。那么，找到一天之中传粉者访花频率最高的时段，也可为有效的人工授粉时间提供依据。若能有效地提高植物的授粉概率，可为促进植物的生殖成功提供参考。

凤仙花属（ImpatiensL.）是被子植物中的一个大属，隶属于凤仙花科（Balsaminaceae），全世界共有900多种，中国作为世界凤仙花属的分布中心之一，拥有该属240多个物种[14]。凤仙花属家族庞大，花朵娇嫩多汁，花部结构复杂，且具有非常广泛的多样性和各个类型的传粉者，是比较理想的研究植物分类学的材料，也是众多传粉生物学家关注的热点类群[15-17]。拥有长花冠筒或是蜜距的植物容易被盗蜜，在该属植物中，长蜜距花被盗蜜的现象十分普遍[15,18,19]。研究盗蜜通过影响传粉者行为而介导该属植物的生殖成功对于理解多物种的相互作用机制及其后果具有重要的意义。

因此，选择了4种颜色（黑、白、红、绿）纱网袋套蜜距，以不套蜜距作为对照，在一天中6个时间段，分别观测红雉凤仙花传粉者的访花频率和单花停留时间，以筛选出对传粉者访花行为影响最小的纱网袋颜色和最佳的访问时间段，便于后续开展盗蜜的生态学研究。

1 材料与方法

1.1 研究地自然概况

实验地位于四川省峨眉山万年寺附近，该区属于亚热带湿润季风气候，主要植被类型是以常绿阔叶为主的亚热带植被，平均气温17.2 ℃，雨量充沛，年均降雨量约1 764 mm[20]。峨眉山因资源植物种类丰富而位居于我国三大资源植物区域之首，尤其是在药用、观赏和食用等方面的资源植物最为丰富多样[21]。峨眉山拥有的植物约占中国植物物种总数的1/10，其中特有凤仙花有12种[22]，是我国凤仙花属植物的集中分布区之一。

1.2 研究材料

研究材料是我国特有植物红雉凤仙花（Impatiens oxyantheraHook.f），隶属于凤仙花科（Balsaminaceae）凤仙花属（ImpatiensL.）。红雉凤仙花高20～40 cm，全株无毛。总花梗生于上部叶腋，长于叶柄短于叶；苞片卵形，顶端突尖；花大，红色或淡紫红色[14]。花冠筒长约为20.4 mm，蜜距长约29.5 mm[10]。其主要的传粉者为三条熊蜂（Bombus trifasciatusSmith），主要的盗蜜者为短头熊蜂（Bombus brevicepsSmith），前期观察该植物发现盗蜜程度可达90.58%[15]。

1.3 实验设计

实验在峨眉山市黄湾乡黑水村租用的农用地（29°36′N，103°21′E，海拔 908 m）中进行。2017年3月底，将野生红雉凤仙花幼苗移栽至花盆。花盆底部先铺放一层瓦片以便排水透气，再装入农用地土壤，每个花盆中施有机肥100 g。每个花盆栽种1株幼苗，共216株，将所有花盆放置在6个2 m ×2 m小区中，每个小区内按6行6列放置。红雉凤仙花喜阴湿环境，在试验地上方覆盖一层黑色塑料遮阳网（型号XN-95，遮阳网下相对光强 24 %，都江堰市新农遮阳网厂）。实验期间常浇水除草，夏季炎热时，早晚浇水1次，以保证植株正常生长。

红雉凤仙花的花期在8—9月，雌雄异熟。于2017年8月下旬开始实验，实验采用单因素变量法。实验处理前一天使用白色尼龙网袋（40目，15 cm × 10 cm）对未开放的花蕾进行套袋，以防止盗蜜，减少实验干扰。第二天，选取已开放的花分组，每组5朵，每组用4种不同颜色（黑色、白色、红色、绿色）的纱网袋（9 cm × 7 cm）套蜜距，余下1朵自然状态不做处理作为对照（见图1）。红色纱网袋与红雉凤仙花的花冠颜色相近，绿色纱网袋则与植物叶片颜色相似，另外选择对比强烈的黑色和白色纱网袋进行对比。每天4人共观察8组（每人2组），重复观察3 d，共24个重复组。

1.4 指标观测

传粉者的访问频率的观测。于2017年8月21日—8月23日每天上午9:00—9:30、10:00—10:30、11:00—11:30和下午 14:30—15:00、15:30—16:00、16:30—17:00共6个时间段，4人分别记录5种实验处理的目标花朵被传粉者访问的次数。每种处理的8朵花共观察72 h。

图 1 用不同颜色纱网袋对红雉凤仙花蜜距进行套袋Fig. 1 Bagging the nectar spur of Impatiens oxyanthera with different colored gauze bags

传粉者访花单花停留时间的观测。于2017年8月21日—8月23日每天9:30—9:50、10:30—10:50、11:30—11:50、15:00—15:20、16:00—16:20、17:00—17:20共6个时间段，4人分别用秒表记录实验处理的5朵花在上述6个时间段，不同套袋处理花朵被传粉者访问时的单花停留时间。每种处理的8朵花共观察48 h。

1.5 数据计算与分析

用Excel、SPSS软件进行数据处理和图表绘制。数据的正态性和方差齐性分别用非参数检验中的单样Kolmogorov-Smirnov检验和Levene法检验。因数据不满足正态分布，故采用非参数检验的多个独立样本的Kruskal-Wallis H(K)检验分析5种处理之间平均值差异的显著性，检验蜜距所套不同纱网袋的颜色以及时间段两个因素对传粉者访问频率和单花停留时间的影响。在R语言（版本3.6.3）中，用rcompanion包scheirerRayHare()函数分析纱网袋颜色、观测时间段以及两者的交互作用对传粉者访问频率和单花停留时间影响的显著性。

2 结果与分析

2.1 传粉者的访问频率

研究发现，纱网袋颜色和观测时间段两者的交互作用对传粉者访花频率影响不显著（H= 20.395，P> 0.05）（见图2）。不同颜色纱网袋对传粉者访花频率差异显著（χ2= 15.977，P< 0.05）（见图3），尤其在上午9:00—9:30时间段内，黑色纱网袋标记的花朵被访问频率显著低于其他处理（χ2= 10.765，P< 0.05）。对照花朵单花被访问频率最高（0.611 ±0.027次·30 min−1），白色纱网袋标记的花朵被访问次数次之（0.576 ± 0.036 次·30 min−1），黑色纱网袋标记的花朵被访问的频率最少（0.285 ± 0.021次·30 min−1），对照花朵比黑色纱网袋标记的花朵平均访问频率高 0.326 ± 0.006 次·30 min−1（见图 3），白色纱网袋标记花朵的访问频率与对照组花朵最接近。

其中，观测时间段对目标花朵被传粉者访问的频率影响显著（χ2= 30.814，P< 0.001）（见图 4），在观测的6个时间段中，下午14:30—15:00单花访问频率最高（0.725 ± 0.028 次·30 min−1），分别显著高于上午11:00—11:30、下午15:30—16:00以及16:30—17:00的相应值。在上午和下午前半段的访花频率均高于后半段，特别是下午，即上下午均出现了一个访花的高峰期。9:00—9:30、10:00—10:00、14:30—15:00这3个访花频率较高时间段的访花频率约为其他3个时间段的1.75倍。

2.2 传粉者的单花停留时间

图 2 不同颜色和时间段的纱网袋对传粉者访问频率的影响Fig. 2 Effects of different gauze bag colors and observation time periods on the visiting frequency of pollinators

图 3 不同颜色的纱网袋对传粉者访问频率的影响Fig. 3 Effects of different gauze bag colors on the visiting frequency of pollinators

纱网袋颜色和观测时间段两者的交互作用对传粉者单花停留时间影响不显著（H= 22.307，P> 0.05）（见图5）。非参数检验表明，不同颜色纱网袋标记花朵被传粉者访问停留的平均时间差异不显著（χ2=2.306，P> 0.05）（见图6），特别是在上午10:30—10:50期间，不同颜色纱网袋处理与对照组之间的传粉者单花停留时间没有几乎差异。白色纱网袋标记花朵平均停留时间最长5.764 ± 0.238 s，黑色纱网袋标记花朵被传粉者访问平均停留时间最短5.023 ±0.251 s，对照花朵平均停留时间5.133 ± 0.130 s。

不同时间段之间，传粉者访问花朵停留时间差异不显著（χ2= 4.408，P> 0.05）（见图 7）。上午9:30—9:50，访花单花停留时间最长6.327 ± 0.118 s，其他5个时间段内单花停留时间相差无几，平均停留5.299 ± 0.028 s。同时，在访问频率较高的时间段，5种纱网袋之间单花停留时间差异越小，而在访问频率较低的时间段，5种纱网袋之间单花停留时间差异越大。

图 4 时间段对传粉者访问频率的影响Fig. 4 Effects of observation time periods on the visiting frequency of pollinators

3 讨论

3.1 纱网袋颜色对传粉者访花行为的影响

图 5 不同颜色纱网袋、时间段对传粉者单花停留时间的影响Fig. 5 Effects of different gauze bag colors and observation time periods on the visiting duration time of pollinators

图 6 不同颜色纱网袋对传粉者单花停留时间的影响Fig. 6 Effects of different gauze bag colors on the visiting duration time of pollinators

图 7 时间段对传粉者单花停留时间的影响Fig. 7 Effects of observation time periods on the visiting duration time of pollinators

花部综合特征包括花色、形态、大小和气味等[23]，而昆虫访花偏好受花部综合特征影响[24]，有研究表明传粉昆虫对花色具有识别能力[25,26]，花色是吸引传粉者访问的重要因素之一，某一花色对传粉者具有吸引力[2,3]，例如：熊蜂往往更喜欢访问颜色艳丽的花朵，如粉红色、黄色和蓝紫色[27,28]。本研究表明，纱网袋颜色对目标花朵被传粉者访问的频率影响显著，对照花朵被访问频率最多，其次是白色，最少的是黑色纱网袋套蜜距的花朵。由此可见，不同颜色的纱网袋确实会干扰传粉者访花的行为，且白色相对影响最小，黑色影响最大。红雉凤仙花花色为淡紫红色，熊蜂喜欢粉红色花冠，有研究发现白色花冠反射光谱的波峰与粉色的花冠有重合[27]，不会对花色产生太大干扰，因此套白色纱网袋的花相比其他纱网袋颜色更容易被熊蜂识别，所以访花频率更接近对照。黑色花颜色不艳丽、不易吸引昆虫，加上黑色吸收全部光波，阳光下升温快致使花组织受到伤害[29]，因此自然界黑色花很少。先前也有研究发现黑色令蜂类产生明显的趋避作用[30]，与本研究结果相似。另一研究结果为纱网袋颜色对传粉者单花停留时间无显著影响。说明一旦传粉者访问花朵后，在花上停留的时间可能不受纱网袋颜色的影响，而受花朵的花部特征如花冠大小、花蜜体积和含糖量等的影响[11-13]。本实验的花为随机选择，并进行随机处理，故受试花朵在花冠大小、花蜜特征无显著差异，并且纱网袋套蜜距外，传粉者访花是在花冠内活动，故传粉者单花停留时间受其直接影响小。最终导致纱网袋颜色对传粉者单花停留时间无显著影响。

3.2 观测时间段对传粉者访花行为的影响

传粉者的活动会受到气温、光照和蜜源丰富度等的影响[13,31]。本研究表明，观测时间段对目标花朵被传粉者访问的频率和单花停留时间影响均显著。下午14:30—15:00访问次数最多，其次是上午9:00—9:30和10:00—10:30，而上午9:30—9:50单花停留时间最长。传粉者一天中的访问节律与光照强度、气温等环境因子以及植物的花部特征、花蜜产量等有关[10-12]，使得传粉者在不同的时间段内其访问频率和单花停留时间差异显著。上午9:30—9:50，单花停留时间最长，有研究发现该时间段花蜜体积较多和果糖含量较高[13]，吸引传粉昆虫觅食。下午14:30—15:00访问次数较多，该时间段也存在花蜜糖浓度升高的现象[13]，这与访问次数多相对应。

综上所述，用白色纱网袋套红雉凤仙花蜜距对传粉者访花行为干扰最小，观测时间以上午9:30—9:50和下午14:30—15:00为宜。这为今后开展盗蜜对植物与传粉互利共生关系影响以及对传粉者干扰最小的隔离方法等研究提供了新的参考。