复合微生物降解豆粕固态发酵条件的探讨

2021-03-05段为旦冷伟芳刘谢缘冷桂华习小文廖金贤

粮油与饲料科技 2021年6期

段为旦,冷伟芳,刘谢缘,冷桂华,习小文，廖金贤

（1.宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 336000；2.上海海洋大学食品学院，上海201306；3.抚州市农业技术推广中心，抚州344000；4.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建厦门361021）

大豆是一年生草本植物，世界上许多国家的比较重要的豆类，根据大豆的种子和种皮可以分为饲料豆、青大豆、黄大豆、黑大豆和其他大豆[1]。大豆中富含许多优质蛋白，含有丰富的人体必需氨基酸[2]，同样也是许多动物饲料中的植物蛋白原料。但大豆蛋白的分子量相当大，分子结构复杂，所以在动物胃肠道里面经过消化酶作用后，主要以肽的形式被吸收。大豆蛋白不但为生物体提供生长、发育所需的营养，还能提高其身体免疫力，促进其新陈代谢[3]。豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产物，豆粕是制作动物饲料的主要原料，还可以用来制作糕点食品、以及化妆品和抗菌素原料。以豆粕为原料，经过微生物发酵分解生成许多小分子物质如多肽类等。

大豆肽是生物活性肽，在代谢调控方面具有非常重要的作用，其中一些多肽的理化性质比大豆蛋白好，溶解性比较好，吸水性比较稳定，基本不受PH影响，具有较好的低黏性和较高的流动性，此外，降解豆粕小分子物质的相对分子量较小（1000KD)，容易消化吸收，其致敏性也比较低，适合食品、动物饲料、鱼粉等的生产加工。降解豆粕在工业生产中主要以酶水解法和微生物发酵法为主[4][5]，微生物水解法又包括固态发酵法和液态发酵法，酶水解法制备的产品会产生不利于产品的味道，使产品口感差[6]。所以本试验采用微生物发酵法中的固态发酵法，改善降解豆粕产生的大豆肽的品质，提高大豆肽的产量，消除抗营养因子[7]，对发酵条件进行优化，完善好豆粕发酵的工艺，来提高降解豆粕的效率，为大豆肽以及动物饲料的后续研究试验及工业化生产与应用提供基础。

1 材料和设备

1.1 试验菌种

枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌、根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉为实验室提供菌种。

1.2 试验材料

大豆粕（粉碎过筛）、麸皮（均为市场购买）；牛血清蛋白（标准品）；葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、硝酸铵、氢氧化钠、碳酸钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、三氯乙酸、福林酚试剂、甲醛等

1.3 主要设备

分析天平、紫外可见分光分光光度计、离心机、超净工作台、生化培养箱、酸度计、磁力搅拌器、全自动高温杀菌锅、烘箱

2 试验方法

2.1 工艺流程

保存菌种→菌种活化→菌种扩增→接种→发酵转化→灭活→粉碎→浸提→离心→取上清液→测可溶性蛋白含量、多肽含量、氨基酸含量

2.2 主要操作要点

2.2.1 菌种活化2.2.1.1根霉F、根霉G、里氏木霉、白腐菌种培养基（PDA培养基)

20%马铃薯、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.05%氯化镁、0.03%磷酸二氢钾、0.03%磷酸氢二钾，自然PH，配制成50mL培养基。在超净工作台中，将保藏在甘油管的根霉F、根霉G、里氏木霉、白腐解封后分别接种到50mL培养基中，在28℃、120r/min条件下恒温摇床中活化培养7d左右。

2.2.1 .2 枯草芽孢杆菌培养基

1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.5%氯化钠，自然PH，配制成50mL培养基。在超净工作台中，将保藏在甘油管的枯草芽孢杆菌解封后分别接种到50mL培养基中，在37℃、120r/min条件下恒温摇床中活化培养2d左右。

2.2.1 .3 酵母菌培养基

1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖，自然PH，配制成50mL培养基。在超净工作台中，将保藏在甘油管的酵母菌解封后分别接种到50mL培养基中，在37℃、120r/min条件下恒温摇床中活化培养2 d左右。

2.2.1 .4 乳杆菌培养基

乳杆菌培养基：5%牛肉膏、0.5%蛋白胨、0.5%酵母浸，PH调至6.8，配制成50mL培养基。将保藏在甘油管的酵母菌解封后分别接种到50mL培养基中，在37℃、120r/min条件下恒温摇床中活化培养2d左右。

活化结束后，枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母杆菌等菌菌液出现明显浑浊，而根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉等菌液中菌体成可见团状，菌液表面覆盖一层白色菌膜，若菌体保存时间过久，初始活力不足，可适当延长活化时间。

2.2.2 种子液扩增培养

活化和扩增的培养基成分一致，将装有的种子液扩增培养基的锥形瓶包扎好放入高压灭菌锅，在121℃，0.12MPa的条件下杀菌30min。待杀菌完成后，将锥形瓶放入超净工作台上冷却。温度合适时，取适量的活化后的菌液，注入的含相适应培养基的锥形瓶中，接种时注意防止染上杂菌，接种后用纱布或者牛皮纸封口，轻轻摇匀混合，放入37℃、转速为180r/min的恒温培养振荡器中培养24h（根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉培养72h）。将扩增后的菌液作为种子液备用。

2.2.2 发酵转化

将活化扩增好的种子液在无菌环境下接种到固体培养基中，置于恒温生化培养箱中，在不同的发酵条件下，复合微生物利用自身产生的酶将豆粕进行降解，分解转化成许多小分子物质。

2.2.3 发酵液的提取

豆粕固态发酵培养后，将发酵后的豆粕及其菌种放入100℃的烘箱进行30min加热灭活。灭活后的豆粕用研钵进行研磨粉碎处理，处理好的样品称取0.5g,加入8mL蒸馏水并放入超声器里超声、水浴加热65℃30min进行浸提，用振荡机振荡5min，倒出上层液体于离心管中，以10000r/min转速离心10min。离心后倒出上清液，取到所需的发酵液。

2.3 分析测定方法

2.3.1 水溶性蛋白、多肽的测定

2.3.1 .1 蛋白质标准曲线绘制[8]

精确称量0.0025g的牛血清蛋白，于10mL容量瓶中配制成250μg/mL的标准蛋白液，取七只试管编号，分别取0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL加入七只试管中，再加蒸馏水至1mL，然后依次加入碱性铜溶液5mL，摇匀混合，静置10min后，加入试剂乙（福林酚试剂）0.5mL，立即混匀，于避光静置30min，以1号管为空白，在680nm波长处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标绘制标准曲线，标准蛋白溶液浓度于吸光度的关系见图1，图1中吸光度值为3次测试结果的平均值，其回归方程为y=0.002x+0.0037,相关系数R2=0.9989。

2.3.1 .2 水溶性蛋白的测定[8]

将浸提好的发酵液放入离心管中于转速10000r/min的离心机中离心10min，上清液倒出备用，准确吸取1.0mL的上清液，稀释至适合的浓度（测定吸光度值在0.2～0.8之间），在稀释至一定浓度的试管中分别加入碱性铜溶液5mL，摇匀，静置10min后，加入福林-酚试剂0.5mL，立即混匀，避光静置30min，同样以上述以1号管为空白，在680nm波长处测定吸光度，测定3次，记录数据，取3次数据的平均值。将数据代入福林酚标准曲线中计算出蛋白浓度，乘以稀释倍数算出发酵液中蛋白质的浓度，再乘以发酵液的量即得出发酵液中蛋白质的量，最后除以称取样品的量，可以得出样品中蛋白质的浓度（见图1）。

图1 蛋白质标准曲线

2.3.1 .3 多肽的测定[9]

将提取好的发酵液放入离心管中于转速10000r/min的离心机中离心10min，上清液倒出备用，取离心好的上清液1.0mL加入30%三氯乙酸1mL，再次在转速10000r/min离心机中离心10min，取上清液稀释至一定浓度（测定吸光值在0.2～0.8之间），再分别加入碱性铜溶液5mL，摇匀，静置10min后，加入福林酚试剂0.5mL，立即混匀，避光静置30min，同样以上述以1号管为空白，在680nm波长处测定吸光度，测定3次，记录数据，取3次数据的平均值。将数据代入福林酚标准曲线中计算出多肽的浓度，乘以稀释倍数算出发酵液中多肽的浓度，再乘以发酵液的量即得出发酵液中多肽的量，最后除以称取样品的量，可以得出样品中多肽的浓度。

2.3.2 氨基酸的测定[10]

准确吸取离心好的上清液1.0mL，置于200mL烧杯中，加水60mL，插入酸度计，开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNAOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录用去氢氧化钠标准溶液的毫升数（按总酸计算公式，可以算出发酵液的总酸含量）。向上述溶液中，准确加入甲醛溶液10mL，混匀。继续用0.05mol/L NAOH标准溶液滴定至pH9.2，记录用去氢氧化钠标准溶液的毫升数，供计算氨基酸态氮含量用。

3 结果与分析

3.1 菌液配比对降解豆粕的影响

采用对比试验法，在其他条件不变的情况下，改变菌液中微生物的配比。试验分别枯草芽孢杆菌：酵母菌、根霉F：根霉G：白腐：里氏木霉：乳酸杆菌=12：8：4：4：1：1：2和枯草芽孢杆菌：酵母菌：根霉F:根霉G=6：2：1：1为条件，待发酵完成后，对水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量进行测定比较，得出试验结果，试验结果见表1：

表1 菌液配比对降解豆粕的影响

由表1的试验结果表明，在其他条件不变的情况下，菌液配比对产生大豆肽的影响不同。数据显示，在枯草芽孢杆菌：酵母菌：根霉F：根霉G=6：2：1：1发酵条件下多肽含量更高，所以试验结果得出枯草芽孢杆菌：酵母菌：根霉F：根霉G:=6：2：1：1更有利于降解豆粕。

3.2 复合微生物菌液接种量对降解豆粕的影响

采用对比试验法，在其他试验条件不变的情况下，改变复合微生物菌液接种量。试验分别以复合微生物菌液接种量0mL、12mL、15mL、18mL为条件，待发酵完成后，对水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量进行测定比较，得出试验结果，试验结果见表2：

表2 复合微生物菌液接种量对降解豆粕的影响

由表2的试验结果表明：复合微生物菌液接种量对降解豆粕的影响不同。在一定范围内，随着菌液接种量的增多，多肽含量也随之增加，但培养基能够提供的营养物质和生存空间是有限的，超过一定的范围并不会增加多肽的含量。在其他条件相同的情况下，与空白组多肽量为29.902mg/g相比较，接种量18mL组多肽量增加了66.179mg/g。接种量18mL时多肽含量最高。根据试验结果得出接种量在18mL时为较优条件。

3.3 固态发酵培养基中的水分含量对豆粕降解的影响

采用对比试验法，改变固态发酵培养基中的固液比。试验分别以固态发酵培养基中的固液比（固态：液态）：1：0.8、1：1.0、1：1.2、1：1.4，1：1.6为条件，待发酵完成后，对可溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量进行测定比较，得出试验结果。以下为试验结果，见图2：

图2 固态发酵培养基中的水分含量对豆粕降解的影响

水分含量对固态发酵有着重要影响，水分含量的高低影响培养基的透气性，从而影响发酵菌种的生长。由图2的数据变化趋势表明：随着固态发酵培养基中的水分含量的增多，可溶性蛋白和多肽含量先增加后减少，培养基中的固液比（固态：液态）为1：1.2时可溶性蛋白和多肽含量最高。所以根据试验结果可得出固态发酵培养基中的水分含量固液比（固态：液态）在1：1.2时为较优发酵条件。