米曲霉固态发酵青稞酒糟的研究

杨延玲，杨 刚

(1.南阳市动物疫病预防控制中心，河南 南阳 47300；2.河南工业大学生物工程学院，郑州 450001)

青稞酒是青藏高原的传统饮品，在酿造青稞酒的过程中会有大量的青稞酒糟产生[1]，青稞酒糟价格便宜，粗蛋白含量超过20%，蛋白质品质优良，可溶性蛋白高，能被瘤胃快速降解吸收，碳水化合物瘤胃利用效率高于其他酒糟，瘤胃降解率较高，对于牛羊饲养效果明显[2]。但青稞酒糟中纤维素含量较高，直接饲喂动物时，畜禽消化率低。研究表明，青稞酒糟通过微生物发酵可以显著提高其粗蛋白含量[3]，将其应用于饲料工业，可有效避免青稞酒糟的浪费，降低养殖成本。青贮发酵的青稞酒糟用于育肥牛中，可以显著提高粗饲料的品质、减少精饲料的使用[4-5]。

米曲霉是食品和饲料工业常用的微生物菌种之一，用于多种饲料资源的发酵，可以显著提高发酵饲料的营养价值[5]，但米曲霉用于青稞酒糟的研究尚未见报道。因此，本试验使用米曲霉发酵青稞酒糟，对其发酵过程中营养成分的变化规律进行研究，为青稞酒糟资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂

米曲霉(Aspergililusoryzae)，实验室保存。玉米粉、麸皮、豆粕为市售，其他试剂使用国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 米曲霉孢子液制备 先将保藏的米曲霉分离纯化，然后在PDA培养基中划线接种，30 ℃条件下静置培养72 h，灭菌生理盐水冲洗平板，平板计数法调整最终孢子液浓度为1×108/mL 左右。

1.2.2 青稞酒糟固态发酵培养基优化 以青稞酒糟为主要原料，加入不同含量的玉米粉(0、2.5%、5.0%)、麸皮(0、2.5%、5.0%)、豆粕(0、2.5%、5.0%)、无机盐(0、2%、4%)，设计四因素三水平正交试验，共9个处理组(表1)，每个处理组设3个重复，并设空白对照。其中，无机盐的配比为：尿素25%、磷酸二氢钾12.5%、硫酸镁12.5%、硫酸锰10%、硫酸锌10%、氯化钴5% 。

表1 青稞酒糟培养基优化正交实验设计

将青稞酒糟和其他培养基混合均匀后，用Ca(OH)2调整pH值为7.0，放入高压灭菌锅，121 ℃高压20 min后，接种4%的米曲霉孢子液，保持固液比为1∶1.5，30 ℃下静置培养5 d，检测发酵后青稞酒糟中羧甲基纤维素酶活力和各种纤维素降解率。

1.2.3 米曲霉固体发酵青稞酒糟过程中酶活和营养物质变化规律 根据上述优化的培养基，加入4%的米曲霉孢子液进行发酵，持续7 d，每隔24 h取样检测，测定不同时间青稞酒糟中羧甲基纤维素酶活力和蛋白酶活力、青稞酒糟可溶性糖含量、纤维素含量的变化，每个处理3个重复。根据实验结果，选取发酵第5天的青稞酒糟，测定其中氨基酸含量，并与空白样品进行对比。

1.2.4 青稞酒糟中酶活和营养物质的检测方法 羧甲基纤维素(CMC)酶活力测定采用DNS法[7]。酶活力单位定义为：在本试验条件下酶活力定义为以对催化底物水解反应1 h形成1 μmol葡萄糖的酶量为1U。蛋白酶活力测定采用Folin酚法[8]。水解液中还原糖含量测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法[9]。粗纤维成分测定采用Van Soest分析方法[10]。氨基酸含量使用氨基酸自动分析仪测定。

1.3 数据统计和分析

采用SAS统计软件进行方差分析和多重比较，试验数据均以平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 青稞酒糟发酵培养基的优化

2.1.1 以纤维素降解为指标的发酵培养基优化 以纤维素含量为指标，青稞酒糟优化培养基的正交试验结果见表2。说明在青稞酒糟中添加5%玉米粉，2.5%麸皮，5%豆粕，4%无机盐时，青稞酒糟中纤维素降解情况最好。R值结果表明，培养基中无机盐、麸皮、豆粕和玉米粉对纤维素降解影响依次减小，其中最主要的因素是无机盐。

表2 以纤维素降解为指标的培养基优化

表3为纤维素降解培养基优化的方差分析表。从表3结果可知，无机盐、豆粕和玉米粉对青稞酒糟的纤维素降解影响极显著(P<0.01)，麸皮对纤维素降解没有明显影响。

表3 纤维素降解为指标培养基优化的方差分析

2.1.2 以羧甲基纤维素酶活为指标的发酵培养基优化 以羧甲基纤维素酶活力为指标，青稞酒糟培养基优化正交试验结果如表4所示。由表4可知，在青稞酒糟中添加玉米粉2.5%，麸皮2.5%，豆粕5%，无机盐4%时，羧甲基纤维素酶活力最高。R值大小从小到大排序为麸皮，玉米粉，豆粕，无机盐，说明培养基中无机盐、豆粕、玉米粉和麸皮对羧甲基纤维素酶产生的影响程度依次降低，其中对于羧甲基纤维素酶活最重要的因素是无机盐。

表4 以羧甲基纤维素酶酶活为指标的培养基优化

以羧甲基纤维素酶为指标的培养基优化的方差分析表见表5。由表5可知，豆粕、玉米粉、无机盐和麸皮4个因素均对羧甲基纤维素酶的影响极为显著(P<0.01)。

表5 以羧甲基纤维素酶活为指标的培养基优化的方差分析

2.1.3 纤维素降解最优培养基的确定 青稞酒糟中纤维素含量较高，有效利用其中的纤维素，将其转化为微生物蛋白和糖类等营养物质，是米曲霉固态发酵青稞酒糟的首要目的，因此，试验中将纤维素的降解和纤维素酶活力作为评价培养基的技术指标。通过正交试验对比，A3B2C3D3是降解纤维素效果最好的组合，A2B2C3D3是羧甲基纤维素酶酶活最高的组合。综合以上结果，青稞酒糟生物降解的最优培养基组合为A3B2C3D3，即5%的玉米粉、2.5%的麸皮、5%的豆粕和4%的无机盐。

2.2 米曲霉固态发酵过程中青稞酒糟酶活力及营养成分变化

2.2.1 酶活力变化 由表6可知，米曲霉发酵青稞酒糟过程中，羧甲基纤维素酶活随着时间的增加，1～6 d整体呈上升趋势，而在第7天随着纤维素浓度降低则大幅降低(P<0.05)。在发酵期内，前3 d蛋白酶酶活上升显著(P<0.05)，之后基本保持稳定。

表6 米曲霉发酵青稞酒糟过程中羧甲基纤维素酶活力、蛋白酶活力和可溶性糖含量变化

2.2.2 可溶性糖含量及纤维成分变化 由表6可知，随着发酵时间的推移，青稞酒糟中可溶性糖含量基本呈现下降趋势，前3 d下降趋势显著(P<0.05)，之后基本稳定。

由表7可知，青稞酒糟中的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素和半纤维素的含量随着时间推移逐渐降低，发酵3 d、5 d和7 d时差异显著(P<0.05)，整个发酵过程中木质素降低不显著(P>0.05)。

表7 不同发酵时间青稞酒糟的纤维成分变化(以干物质为基础) %

2.2.3 米曲霉发酵过程中氨基酸含量变化 选取第5天的发酵酒糟进行氨基酸含量测定，结果如表8所示。结果表明，米曲霉发酵青稞酒糟后，其中的纤维素被米曲霉利用，转化为蛋白质和氨基酸，氨基酸总量、蛋氨酸和赖氨酸等必需氨基酸含量得以提升。

表8 发酵5 d青稞酒糟氨基酸含量 %

3 结论

试验结果表明，米曲霉固体发酵青稞酒糟的最佳培养基成分配比为5%的玉米粉、2.5%的麸皮、5%的豆粕和4%的无机盐。通过发酵，可以降低青稞酒糟中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素和半纤维素的含量，提高粗蛋白和氨基酸含量，增加了青稞酒糟作为饲料的营养价值。