基于网络药理学葛根生津止渴功效的生物机制研究

★ 翟兴英 涂珺 李佳 姜丽 张启云 徐国良 黄超东 李冰涛（江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心/江西省中医病因生物学重点实验室 南昌 330004）

葛根为豆科植物野葛的干燥根，习称野葛。2020年版《中国药典》记载葛根具有解肌退热、生津止渴的功效。胰岛素抵抗使胰岛素敏感性降低，其导致血糖升高、脂肪及蛋白质分解作用增强，渗透压升高，使患者出现“三多一少”的典型糖尿病临床症状。基于分子对接技术发现葛根多种化学成分与胰岛素抵抗靶点具有较好的结合作用［1］。葛根总黄酮能有效降低链脲佐菌素复制的糖尿病小鼠的血糖水平，恢复胰岛素水平，改善实验小鼠的胰岛素抵抗状态［2］。葛根生津止渴功效与其改善胰岛素抵抗作用相关，但是其生物机制还未知。网络药理学是一种系统生物学技术，能够从整体上分析药材的潜在作用机制，为中药多成分多靶点作用生物机制研究提供新的研究思路和研究方法。本研究以葛根胰岛素抵抗为研究对象，应用网络药理学技术探索葛根“生津止渴”的生物机制，为葛根实验研究及产品开发提供科学依据。

1 方法

1.1 葛根化学成分及活性成分［3］基于化学专业数据库检索葛根活性成分［4］。删除来源于茎、叶的化学成分，保留来源于地下根的化学成分，依据Linpinski五规则对化学成分进行活性筛选［5］。

1.2 活性成分作用靶点 Swiss Target Prediction是一款在线分析工具［6］，能够依据化学成分预测其潜在作用靶点。本研究使用Swiss Target Prediction 预测活性成分作用靶点。

1.3 胰岛素抵抗疾病靶点及葛根作用靶点收集GenCLiP 3是一款在线文本挖掘工具［7］，能够通过输入疾病关键词查找、分析疾病相关的人类基因。为了提高获取靶点的可靠性，本研究将杂志影响因子选择为3～50，发表年限为1990年—2020年。

将葛根活性成分作用靶点与胰岛素抵抗疾病靶点进行交叉分析，考虑靶点在胰岛素抵抗的三大组织（肝、骨骼肌、脂肪）分布，提高作用靶点的可靠性，以药材及疾病共有靶点且在三大组织有蛋白表达的靶点为葛根改善胰岛素抵抗作用靶点。

1.4 活性成分-作用靶点网络 以活性成分及葛根改善胰岛素抵抗作用靶点的对应关系，构建活性成分及作用靶点网络。用网络中节点的度值评价活性成分重要性。

1.5 作用靶点的PPI网络 STRING数据库旨在提供多物种蛋白质交互作用的数据，本研究将葛根改善胰岛素抵抗的作用靶点导入STRING数据库［8］，构建靶点的交互作用网络，基于节点在交互作用网络中度中心型评价靶点重要性。

1.6 生物功能富集 生物学信息注释数据库（DAVID）是常用的通路富集数据库［9］。本研究将葛根改善胰岛素抵抗的作用靶点导入DAVID数据库，对靶点进行KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 葛根化学成分及活性成分 本研究基于化学成分数据库检索葛根化学成分119个， 94个成分符合Linpinski 5规则 ，可能是葛根的活性成分。

2.2 葛根改善胰岛素抵抗的作用靶点 本研究预测葛根活性成分作用靶点188个，发现胰岛素抵抗疾病靶点706个，葛根活性成分及胰岛素抵抗疾病共有靶点40个，其中24个共有靶点在胰岛素抵抗主要组织肝脏、骨骼肌及脂肪有蛋白表达，可能是葛根改善胰岛素抵抗的作用靶点。见表1。

表1 葛根改善胰岛素抵抗作用靶点

2.3 葛根活性成分-作用靶点网络 应用cytoscape 3.3.0软件，依据预测的成分及靶点对应关系，构建葛根改善胰岛素抵抗的活性成分-靶点作用网络。该网络共有67个节点，103条边。67个节点中24个为靶点，其与43个节点为葛根活性成分。对网络节点的中心性分析，发现葛根活性成分中M35（sayanedine），M40（genistein），M33（3'-methoxydaidzein），M39（glycitein），M42（formononetin）的度值排序靠前，具有较多的作用靶点。可能是葛根改善胰岛素抵抗的主要活性成分。

图1 葛根改善胰岛素抵抗的活性成分-作用靶点网络

2.4 葛根改善胰岛素抵抗作用靶点的PPI网络 将葛根改善胰岛素抵抗的作用靶点导入STRING数据库，并设置蛋白交互作用可信度为中等，构建靶点交互作用关系网络，导出至cytoscape 软件构对网络进行可视化及网络分析。该网络有23个节点（蛋白在此交互作用置信条件下与其他蛋白无交互作用），47条边。节点中心性分析发现EGFR（12），ESR1（9），PTGS2（9）的中心性较大，可能是药物作用的重要节点。见图2。

图2 葛根改善胰岛素抵抗作用靶点的交互作用网络

2.5 通路富集分析 本研究使用DAVID在线工具对葛根改善胰岛素抵抗作用靶点进行KEGG通路分析。葛根改善胰岛素抵抗靶点富集显著性代谢通路10条，涉及钙离子信号通路，胆汁酸分泌通路，缺氧诱导因子1通路等。见图3。

图3 葛根改善胰岛素抵抗作用靶点通路富集

3 讨论

葛根具有生津止渴的功效，主消渴，2型糖尿病属消渴的范畴，临床上，葛根常用于2型糖尿病的治疗，胰岛素抵抗是2型糖尿病的发病机制之一。为了探索葛根生津止渴功效的科学内涵，本研究基于胰岛素抵抗应用网络药理学技术构建了葛根改善胰岛素抵抗的成分靶点交互作用网络，探索了葛根改善胰岛素抵抗的作用靶点，并富集靶点的作用通路。

基于葛根活性成分-靶点交互作用网络，研究初步发现葛根43个作用于胰岛素抗疾病靶点的活性成分。其中M35（sayanedine），M40（genistein），M33（3'-methoxydaidzein ），M39（glycitein），M42（formononetin）可能是葛根改善胰岛素抵抗的主要活性成分。染料木黄酮（Genistein）是葛根中异黄酮类成分，能够调控大鼠胰岛素分泌，影响肝脏和脂肪组织的脂代谢［10-12］。3'-甲氧基大豆苷元（3'-methoxydaidzein）是一种家甲氧基异黄酮类化合物，现代研究该类化合物具有改善胰岛素抵抗、改善调节脂代谢紊乱等作用；此外研究结果显示3’-甲氧基大豆苷元具有较强的α葡糖糖苷酶抑制作用，能够抑制葡萄糖的吸收［13-14］，此外，染料木素（glycitein）和芒柄花素（formononetin）均具有改善胰岛素抵抗的作用［15］。

本研究发现葛根改善胰岛素抵抗的24个潜在作用靶点，其中靶点EGFR、PTGS2、ESR1可能是重要靶点。EGFR是表皮生长因子受体，EGFR能够通过PPARγ途径,激活促进NFκB激活，抑制炎症的发生［16］，炎症学说是糖尿病发病学说之一。环氧合酶是花生四烯酸代谢通路中关键限速酶，环氧合酶-2（PTGS2）催化花生四烯酸生产前列腺素等一系列炎性介质。肥胖诱发的炎症是胰岛素抵抗发展的重要因素［17］。研究表明，葛根中阿魏酸、芹菜素、异甘草素等化学成分能够抑制细胞或实验动物PTGS2的表达［18-20］。2型糖尿病的患病率具有明显的性别差异，绝经前女性的发病率明显较低。雌激素缺乏可能与代谢功能障碍之间存在较强的相关性，女性雌激素的减少可加速胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生。雌激素是通过激活雌激素受体信号来抑制肝脏葡萄糖产生的［21］。葛根中活性成分大豆苷元、芒柄花素、染料木素等多种异黄酮类成分具有植物雌激素样作用，能够调节雌激素受体的表达［22-24］。

对葛根改善胰岛素抵抗靶点进行通路富集分析，发现钙离子信号通路，胆汁酸分泌信号通路及缺氧诱导因子信号通路等是显著性信号通路。钙是信号转导途径中重要的第二信使，主要存贮在细胞的内质网中，维持适量的钙离子浓度有利于内质网中蛋白质折叠和运输，反之，则内质网中蛋白质折叠和运输功能异常，诱发内质网应激。内质网应激通过JNK和IRS-1通路在激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和Akt/蛋白激酶B（PKB）途径导致葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）囊泡到细胞表面，促进胰岛素抵抗［25］。胆汁酸由肝脏分泌，作为一种代谢调节因子,能够激活多种核受体和膜受体介导的信号通路,参与多种代谢调节过程,不仅可以促进食物中脂类的消化吸收,还参与糖、脂及能量的代谢,同时胆汁酸又是代谢稳态的关键调节剂，其代谢和信号转导的改变与肥胖和2型糖尿病相关［26］。缺氧诱导因子（HIF）是一种由缺氧激活的转录因子，在多种组织器官中表达，参与调控血管生成、细胞增殖和炎症等，与多种代谢疾病均有关联。脂肪组织和小肠缺氧，激活缺氧诱导因子HIF1α和HIF2α，导致胰岛素抵抗; 小肠中HIF2α的激活增加唾液酸酶3的表达，导致小肠和血清的神经酰胺升高，促进胰岛素抵抗和糖尿病的发生; 此外，脂肪细胞中HIF1α可诱导SOCS3表达来活化STAT3，增强炎症因子表达、减少脂联素表达，导致胰岛素抵抗［27］。

葛根具有生津止渴的功效，临床上可以改善胰岛素抵抗，治疗糖尿病，改善糖尿病三多一少的临床症状。本研究基于胰岛素抵抗应用网络药理学技术探索葛根活性物质、作用靶点及通路，初步研究发现葛根活性成分，可以作用于EGFR,ESR1，PTGS2等胰岛素抵抗疾病靶点，通过钙离子信号、胆汁酸代谢、缺氧诱导因子等信号通路发挥生津止渴的功效，改善胰岛素抵抗，治疗糖尿病等疾病，为葛根功效深入研究提供了科学依据。