菟丝子提取物对失眠大鼠血清细胞因子及SOD、MDA的影响

★ 刘海云 方永青 何志坚 伍庆华 宋渺渺 林倩霞 侯本超（.江西中医药大学中医学院 南昌 0004；.江西省肿瘤医院 南昌 009；.南昌大学第一附属医院 南昌 0006）

随着生活压力逐渐增加，失眠的人数量越来越多。据调查，失眠症发生率为10 %～60 %，因地区不同而概率不同，老年人患上失眠症一般在30 %～40 %之间,但在某些地区甚至可以达到90 %以上［1］。失眠症的主要表现为夜间时无法入睡, 长久的失眠会引起机体免疫力下降，记忆力、注意力等认知功能损害，同时持续失眠还会增加很多慢性基础性疾病的风险［2-3］。

研究显示，睡眠剥夺能加快机体新陈代谢，增加自由基，降低超氧化物歧化酶（SOD）活性，并形成大量脂质过氧化物丙二醛（MDA）［4］。长期睡眠剥夺病理表现的突出特征为能量消耗过多，在此过程中常产生大量活性氧，大量的氧自由基堆积，当这些含氧物超过机体的抗氧化能力将引发氧化应激反应。肖爱娇等［5］研究发现热敏灸可以通过调节SOD、MDA的含量恢复机体的氧化平衡状态 ，达到改善睡眠的作用。吴北峰［6］发现采用电项针疗法可以降低脑干内SOD和NO的含量，能够降低氧化应激所导致的能量过度消耗水平，减少氧化应激对脑干的损害，恢复正常睡眠-觉醒周期。

细胞因子不但是重要的免疫调节因子，而且具有广泛的中枢调节作用 ，它们不仅在外周血液单核细胞中释放并存在，而且外周神经和大脑中也存在。因此，细胞因子能通过不同线路影响中枢神经系统的睡眠过程［7］。

目前，对于失眠临床上常用的药物副作用比较大，有成瘾性和依赖性。因此，寻找一种有效而副作用小的药物预防和治疗失眠是当务之急。

菟丝子最初记载于《神农本草经》，又被称为菟丝实、吐丝子等。菟丝子味甘、辛，性平，是常用的补益中药，具有补肝肾、固精缩尿、益精明目等功效，是中医补肾、壮阳、固精之要药［8］。课题组对菟丝子的研究较多，但在失眠方面还未涉及。前期实验结果证实，菟丝子可以改善失眠大鼠的学习记忆能力，对改善失眠有显著效果［9］，但其作用机制不清楚。现从细胞因子及氧化应激的角度进一步探讨中药菟丝子对失眠大鼠的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各30只，体重（200±20）g，购于北京维通利华实验动物有限公司，许可证号 SCXK（京）2016-0011。动物饲养室温为20～22 ℃。室内外空气交换迅速，通风良好。将大鼠雌雄分开于不同的饲养笼中，使用专用的大鼠饲料喂养，自由饮水。在正式的实验开始之前先饲养一至两周。

1.2 试药 中药菟丝子购于南昌益丰大药房；对氯苯丙氨酸（PCPA）试剂盒购于Sigma有限公司；地西泮注射液购于江西省肿瘤医院门诊部；SOD、MDA试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；IL-1β、TNF-α试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器 AdventurerTM电子天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；微量进样器（德国eppendorf公司）；TECAN 酶标仪sunrise（奥地利 TECAN公司）；TGL-16G型台式高速离心机（上海市实验仪器总厂）。

2 方法

2.1 制备菟丝子提取物［10］菟丝子1 000 g，8 000 mL水浸泡2 h，药材微微膨胀，文火煎煮2次，每次0.5 h，合并2次煎煮液，并将其浓缩至0.4 g/mL，置于4 ℃冰箱，备用。

2.2 分组 60只SD大鼠随机分为五组，分别为模型组、空白对照组、地西泮对照组（地西泮注射液0.9 mg/kg）、低剂量菟丝子提取物给药组［菟丝子提取物150 mg/（kg·d）剂量组］、高剂量菟丝子提取物给药组［菟丝子提取物350 mg/（kg·d）剂量组］，每组各12只。

2.3 建立对氯苯丙氨酸失眠大鼠模型 除空白对照组外，其他组都进行腹腔注射对氯苯丙氨酸混悬液（350 mg/kg），每天1次，时间持续3 d［11］。

2.4 给药 建立模型后（即造模第四天），开始对不同组大鼠给药。地西泮对照组的大鼠使用地西泮注射液（0.9 mg/kg）灌胃［12］，给药组选择不同浓度的菟丝子对大鼠进行灌胃，而空白对照组与模型组则都用相同体积的生理盐水对实验大鼠灌胃，每天1次，连续灌胃14 d。

2.5 大鼠血清的制备 最后一次灌胃后，第二天对大鼠进行腹腔注射5 %的戊巴比妥钠（60 mg/kg），将其麻醉。大鼠被麻醉后立刻开腹，选择钝性分离将大鼠体内的脏器分开，腹主动脉取血［13］。置于离心机中进行低温离心，转速为5 000转/min，15 min后，取出，去除沉淀，取上清液将其放置于20 ℃的冰箱。

2.6 血清中IL-1β和TNF-α的测定 放射免疫法测定大鼠血清中IL-1β和TNF-α 的含量进行测定［14］。即在抗原或抗体上利用放射性同位素标记，将其与被测的抗体或者抗原相互结合，形成抗原与抗体相互结合的复合物，利用仪器对形成的抗原抗体复合物来进行分析，并测定其含量。

2.7 血清中SOD活性及MDA含量的测定 按试剂盒的操作进行测定。

2.8 实验数据统计与处理 实验结果使用统计分析软件SPSS 24.0进行处理，得到的结果用（±s）表示，通过多重比较法分析数据并且对每组的数据进行组间相互比较。当P<0.05时具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况 造模前所有大鼠情况正常，饮食健康，睡眠稳定。腹腔注射PCPA两天后，除空白对照组，所有大鼠都呈现失眠状态，昼夜活动紊乱，饮食规律不正常。灌胃一周后，地西泮对照组与高剂量菟丝子给药组的大鼠状况都十分接近正常组，而低剂量给药组的大鼠状况与模型组的差异较大，较为接近空白对照组。从大鼠健康状况可知，菟丝子提取物可较为有效的改善失眠，且高剂量的疗效比低剂量的疗效好。

3.2 菟丝子提取物对失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α含量的影响 实验结果表明，与空白组比较，模型组大鼠IL-1β、TNF-α的含量都显著降低。而与模型组比较，地西泮对照组、低剂量组、高剂量组的大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量都显著增加，其中地西泮对照组和高剂量组的IL-1β、TNF-α含量与空白对照组十分相近。见表1。

表1 菟丝子提取物对失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α水平的影响（±s，n=12） ng/L

表1 菟丝子提取物对失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α水平的影响（±s，n=12） ng/L

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别 IL-1β TNF-α空白对照组 66.88±8.62 41.48±10.08模型组 36.42±13.12** 20.49±12.42**地西泮对照组 56.02±14.81# 36.58±9.47##低剂量组 39.43±12.13# 28.11±13.38#高剂量组 51.02±13.88## 33.02±9.36##

3.3 菟丝子提取物对失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影响 实验结果表明，与空白组比较，模型组大鼠血清中SOD活性显著减少，而MDA含量升高。与模型组比较，地西泮对照组、低剂量组、高剂量组的大鼠血清中SOD的活性都显著增加，MDA的含量下降。其中地西泮对照组与高剂量组的SOD活性和MDA含量均接近空白对照组。见表2。

表2 菟丝子提取物对失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影响（±s，n=12）

表2 菟丝子提取物对失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影响（±s，n=12）

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

组别 SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1空白对照组 84.86±9.09 3.75±0.32模型组 63.05±10.19* 5.15±1.24**地西泮对照组 79.60±7.35# 3.13±1.14##低剂量组 69.59±6.28# 4.04±0.66#高剂量组 74.39±13.34# 3.08±0.31##

4 讨论

采用PCPA建立失眠大鼠模型，消耗的时间比其他造模短，需要的费用也比较便宜,而且这种造模可重复性强，因此，一般都是用这种方法造失眠模型［15］。失眠使机体免疫力下降，免疫系统紊乱，免疫功能失调。而机体免疫能力又和细胞因子如IL-1β、TNF-α有密切的关系。研究表明TNF-α与睡眠调节密切相关，这两者之间能相互调节，这样就可以令机体的睡眠保持在稳定的状态［16］。同时，IL-1β与睡眠有关的，IL-1β水平增加可促进睡眠，而抑制IL-1β则阻止睡眠［17］。本实验模型组IL-1β、TNF-α的含量都低于正常水平，而使用了不同浓度的菟丝子提取物灌胃后血清中IL-1β、TNF-α的含量与模型组相比都有明显升高，高剂量组的这两种细胞因子水平接近阳性对照组，说明菟丝子提取物对大鼠血清中的IL-1β与TNF-α有促进作用。

失眠令大鼠消耗的能量增加、 抗氧化应激的能力减弱［18］。失眠使机体在夜间兴奋，无法入睡，从而导致机体能量消耗增多，而能量产生的过程中往往是伴随着活性氧的生成，能量消耗增加，活性氧含量就不断增加，当产生的活性氧超过机体的抗氧化能力，大鼠体内就会发生使机体受到损害的氧化应激反应。大鼠体内一旦发生这个反应，将产生大量的有害氧化中间产物。丙二醛是机体内的脂质发生过氧化反应得到的物质,这使得生命大分子物质发生交联聚合，而且它还具有使细胞死亡的毒性［19］。为了对抗机体产生损害的反应，机体拥有两个抗氧化系统，其中一个是酶抗氧化系统，另一个则是非酶抗氧化系统。SOD是机体中一种能起到比较重要作用的抗氧化酶，它经常被机体用来去除体内多余的超氧阴离子自由基［19］，是酶抗氧化系统中比较重要的一种酶。实验表明失眠大鼠血清SOD活性明显降低且MDA含量明显升高［20］，可能是失眠大鼠氧自由基大量产生，从而使得SOD的活性下降，导致了体内的氧自由基不断增多,这些氧自由基攻击大鼠体内的多不饱和脂肪酸，从而使大鼠体内的脂质发生过氧化反应，产生MDA等物质，引起细胞毒性，使细胞死亡［5］。本研究中，与空白对照组相比，模型组SOD活性明显降低，MDA含量升高，说明失眠大鼠体内正是由于上述原因而发生了氧化应激反应；而与模型组相比，低、高剂量给药组SOD活性都增加，MDA的含量都减少，说明中药菟丝子提取物具有抗氧化的作用，从而改善了失眠的症状。

本实验结果表明，菟丝子提取物可以提高血清中细胞因子IL-1β与TNF-α的含量，使血清中SOD活性得到提升，降低MDA的含量，从而改善了失眠大鼠的症状。因此，从菟丝子提取物提高失眠大鼠的免疫能力和抗氧化作用的能力来看，其对失眠有一定的治愈效果，本实验为菟丝子治疗失眠的临床应用提供科学理论依据。