蒙花苷对MDA-MB-231细胞雄激素受体的影响

★ 左志琴 沈志华,2（.深圳市中医院 广东 深圳 58040；2.江西中医药大学 南昌 330004）

乳腺癌是全球女性中最常见的癌症类型，每年影响数百万女性［1］。乳腺癌病例中有15 %～20 %被诊断为三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）［2］。临床上，TNBC被定义为雌激素受体（estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progesterone receptor，PR）阴性且缺乏HER2的肿瘤。与激素受体和HER2阳性乳腺癌不同，TNBC 的治疗具有挑战性［3］。由于细胞分化差、分子异质性和快速转移，该病通常会产生化学耐药性［4］。快速复发、侵袭性强和预后较差是TNBC肿瘤的常见特征［5］。因此，迫切需要开发和优化TNBC的靶向治疗。最近，研究证实TNBC患者可表达雄激素受体（androgen receptor，AR），进行抗AR治疗可获益，且AR可以作为TNBC的治疗靶点［6-8］。密蒙花黄酮类化合物结构与雄激素类似，可以发挥拟雄激素效应。前期发现密蒙花主要成分蒙花苷对MCF-7细胞的AR具有调节作用［9］。在此基础上，研究蒙花苷对三阴性乳腺癌细胞株MAD-MB-231细胞AR的表达和细胞迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 MDA-MB-231细胞株购买于中国科学院细胞库，目录号：TCHu227。蒙花苷（购自于上海源叶生物科技有限公司，批号：Z04A9L57508）。CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所，批号：TD826），反转录试剂盒（TAKARA，Cat# RR036A）。全自动酶标仪（RT-6000，Rayto）；台式高速离心机（5417R，德国Eppendorf）；Real-time PCR System（ABI 7500，美国ABI公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 CCK-8检测蒙花苷对MDA-MB-231细胞活力的影响［9］细胞常规培养，干预组用蒙花苷（2.0，6.7，20.0，66.7，100.0 μg/mL）作用于细胞，对照组为正常条件培养的细胞，CCK-8法检测细胞活力，细胞增殖率（%）=（实验组-对照组）/对照组×100 %。

1.2.2 蒙花苷对MDA-MB-231细胞AR mRNA表达的影响［9］干预组用蒙花苷（2.0，6.7，20.0，66.7，100.0 μg/mL）作用于细胞，对照组为正常条件培养的细胞，Real-time PCR检测细胞AR mRNA表达。按RNA 抽提试剂盒步骤提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，取500 ng RNA 按反转录试剂盒步骤进行逆转录反应合成第一链cDNA（RT）。AR引物设计：上游：5-GGGCGAAGTAGAGCATCCT-3，下游：5-GACGACCAGATGGCTGTCATT-3。内参引物GAPDH设计：上游：5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3，下游：5-CTGGGCTACACTGAGCACC-3。由北京六合华大基因科技有限公司公司合成。扩增完毕后，进入结果分析界面，以GHPD为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。

1.2.3 蒙花苷对MDA-MB-231细胞迁移的影响干预组用蒙花苷（6.7，20.0，66.7 μg/mL）作用于细胞，对照组加入DMSO，按每孔4×105个接种至6孔板中，37 ℃、5 % CO2培养箱中培养。待细胞铺满后，用200 μL移液器枪头沿着孔板的中间直线划痕，用培养液冲洗掉划下的细胞，加入新鲜无血清培养基培养24 h。按0、24 h拍照记录，测量划痕间距d，并进行计算，划痕愈合率（%）=（d0h-d24h）/d0h×100 %。

1.3 统计学分析 应用运用SPSS 22.0软件进行统计，所有结果用（±s）来表示。多组间的比较采用完全随机设计的方差分析。两组间的比较，采用t检验；所有统计检验均采用双侧检验。结果以P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 蒙花苷对MDA-MB-231细胞活性的影响 与对照组比较，干预组（蒙花苷2.0，6.7，20.0，66.7 μg/mL）作用24 h后细胞OD值差异不明显（P>0.05），说明细胞活力无明显下降，各蒙花苷浓度组组间差异也不明显（P>0.05）。随蒙花苷作用时间延长和浓度增加，细胞活力呈下降趋势，尤其是当蒙花苷浓度为100 μg/mL时，作用24 h后，OD值较对照组升高，但差异不明显（P>0.05）。作用48 h后，与对照组相比，差异有统计学意义（P>0.05）。作用72 h后，差异有显著意义（P<0.01）。说明蒙花苷对细胞活力的影响与浓度和作用时间有关，且当作用24 h后影响最小。见表1。

表1 蒙花苷不同浓度和作用时间的对MDA-MB-231细胞活力的影响（±s，n=7）

表1 蒙花苷不同浓度和作用时间的对MDA-MB-231细胞活力的影响（±s，n=7）

注：与对照组比较，△P＜0.05，◆P<0.01。

组别 浓度/μg·mL-1 24 h 48 h 72 h对照组0.0 0.21±0.02 0.34±0.02 0.47±0.03 2.0 0.22±0.04 0.34±0.01 0.48±0.01 6.7 0.22±0.02 0.35±0.04 0.51±0.10蒙花苷干预组20.0 0.23±0.03 0.36±0.04 0.56±0.07△66.7 0.23±0.02 0.37±0.06 0.56±0.03△100.0 0.25±0.01 0.42±0.01△ 0.59±0.06◆

2.2 蒙花苷对AR mRNA表达的影响 正常MDAMB-231细胞有AR mRNA表达，经蒙花苷处理细胞后，AR mRNA表达随浓度增加呈增多趋势。当蒙花苷浓度为6.7 μg/mL时，AR mRNA表达明显增加，与正常组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。当浓度为20.0μg/mL 和66.7 μg/mL时，AR表达最高，与正常组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。随后，随浓度增加（100.0 μg/mL），AR mRNA表达减少，但较正常组表达升高，差异无统计学意义。见表2。说明蒙花苷对MDA-MB-231细胞AR的表达有促进作用。由于蒙花苷浓度为200.0 μg/mL时可见结晶现象［9］，浓度为100.0 μg/mL时MDAMB-231细胞活力稍有下降，且此时AR mRNA表达较浓度为6.7，20.0，66.7 μg/mL时减少，结合蒙花苷高浓度对细胞有毒性作用，后期实验舍弃该浓度（100.0 μg/mL）。见图1。

表2 蒙花苷对MDA-MB-231细胞 AR mRNA表达的影响（±s，n=3）

表2 蒙花苷对MDA-MB-231细胞 AR mRNA表达的影响（±s，n=3）

注：与对照组比较，△P<0.05。

组别 浓度/μg·mL-1 AR mRNA对照组0.0 1.00 2.0 0.98±0.10 6.7 1.11±0.04△蒙花苷干预组20.0 1.13±0.03△66.7 1.14±0.04△100.0 1.02±0.06

图1 蒙花苷对MDA-MB-231细胞AR mRNA表达的影响

蒙花苷对MDA-MB-231细胞迁移的影响 对照组MDA-MB-231细胞加入含DMSO的新鲜无血清培养基培养24 h后，细胞划痕间距明显缩小，与0 h相比，差异明显（P<0.01），说明细胞愈合能力强。蒙花苷（6.7，20.0，66.7 μg/mL）作用于细胞24 h后，划痕间距较0 h也明显缩小，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。说明MDA-MB-231细胞侵袭能力强。各蒙花苷干预组与对照组相比，细胞愈合能力明显抑制（P<0.01），随着蒙花苷浓度逐渐增高，抑制细胞愈合逐渐增强，且当浓度为66.7 μg/mL，抑制细胞愈合能力最强，与浓度6.7，20.0 μg/mL相比，差异有统计学意义（P<0.05）。说明蒙花苷对细胞的迁移能力与蒙花苷浓度有关。见图2。

表3 蒙花苷对MDA-MB-231细胞迁移的影响（±s，n=6）

表3 蒙花苷对MDA-MB-231细胞迁移的影响（±s，n=6）

注：与本组治疗前比较，▲P<0.01；与对照组治疗后比较，△P<0.01；与蒙花苷6.7 μg/mL干预组比较，◆P<0.05；与蒙花苷20 μg/mL干预组比较，#P<0.05。

组别 浓度 创面宽度/μm 0 h 24 h对照组 - 451.91±35.23 202.64±11.00▲6.7 μg/mL 444.16±45.98 300.39±7.19▲△蒙花苷干预组 20 μg/mL 451.10±103.65 312.23±19.83▲△66.7 μg/mL 466.80±67.84 356.30±11.53▲△◆#

图2 蒙花苷对MDA-MB-231细胞迁移的影响

3 讨论

AR是类固醇激素受体家族的成员，该家族还包括雌激素、孕激素、糖皮质激素和盐皮质激素受体。在乳腺癌中，AR的表达比ER或PR更广泛，原发性和转移性乳腺肿瘤中超过70 %的AR表达［7］。TNBC 肿瘤的一个子集表达 AR，并且可能受益于抑制 AR 信号通路的治疗。并且AR 最近已成为进一步细化乳腺癌亚型分类的有用标记［10-12］，AR 表达与分化良好的状态和更多惰性乳腺癌相关［13-14］。这意味着AR可能是AR阳性乳腺癌患者的新标志物和潜在治疗靶点。

MDA-MB-231细胞是一种众所周知的TNBC细胞系，具有高度侵袭性，表现出快速的肿瘤生长，并且具有高度转移性，通常用作体外模型来研究各种药物对乳腺癌细胞迁移的影响和作用机制，可作为一种研究AR在三阴性乳腺癌中生物学特性的细胞模型。本研究MDA-MB-231细胞为目标细胞，观察三阴性乳腺癌细胞中是否有AR表达，结果发现正常MDA-MB-231细胞有AR mRNA表达，这与Yan Kong等［15］的研究结果相似。

前期观察蒙花苷对乳腺癌细胞MCF-7AR的影响，发现蒙花苷对MCF-7AR具有双向调节作用，AR mRNA 呈先升高后降低趋势，并发现蒙花苷浓度为200 μg/mL时可见结晶现象［9］。故本实验在此基础上，进一步观察中药密蒙花主要成分蒙花苷不同浓度（0.0，2.0，6.7，20.0，66.7，100.0 μg/mL）对MDA-MB-231细胞AR的影响。首先观察蒙花苷对MDA-MB-231细胞活力的影响，结果显示，蒙花苷作用24 h对MDA-MB-231细胞活力无明显抑制作用，这与蒙花苷对MCF-7细胞活力无明显抑制作用的结果相似［9］。但随蒙花苷作用时间延长和浓度增加，细胞活力呈下降趋势。随后，观察蒙花苷对AR的影响，结果显示正常MDA-MB-231细胞有AR mRNA表达，且ARmRNA表达水平随蒙花苷浓度逐步增加呈增多趋势。这说明蒙花苷对MDA-MB-231细胞乳腺癌细胞株中雄激素受体的表达具有正性调节作用。该结果与蒙花苷对MCF-7 AR mRNA表达呈先升高后降低趋势不一致［9］，考虑蒙花苷对乳腺癌细胞AR的调节与乳腺癌细胞类型有关，提示后期运用中药密蒙花治疗乳腺癌需根据乳腺癌类型来选择治疗浓度。在此基础上，进一步观察蒙花苷对MDA-MB-231细胞迁移的影响，发现对照组24 h后划痕间距明显缩小，蒙花苷作用后，MDA-MB-231细胞的侵袭能力得到抑制，且随浓度增高，抑制能力增强。当浓度为66.7 μg/mL，抑制细胞愈合能力最强。结合蒙花苷对MDA-MB-231细胞AR mRNA表达呈正相关，考虑蒙花苷对MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制作用与蒙花苷促进MDA-MB-231细胞表达AR有关。该结果同时也佐证了AR可作为乳腺癌的治疗靶点［6-8］。

综上，密蒙花能够调节乳腺癌细胞AR的表达，且对三阴性乳腺癌AR的表达密蒙花浓度呈正相关，并呈浓度依赖性抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移。然而，中药密蒙花如何影响三阴性乳腺癌的生长、转移的机制尚不明确。