改性生物炭固定异养硝化菌对水中低浓度氨氮的去除*

2021-03-04王朝旭

环境污染与防治 2021年2期

王朝旭任静

(1.太原理工大学环境科学与工程学院，山西晋中 030600；2.山西省市政工程研究生教育创新中心，山西晋中 030600)

水体氮污染是我国环境可持续发展的重要限制因素之一。国家致力于降低水环境氨氮浓度，以缓解水体黑臭等环境问题。目前，我国多地城镇污水处理厂执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918—2002)一级A标准和《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)Ⅴ类。因此，低浓度氨氮废水处理成为当前研究热点。一般来说，氨氮≤50 mg/L的废水称为低浓度氨氮废水[1]。

针对低浓度氨氮废水处理已有较多研究[2-3]。主要处理方法有化学沉淀法、离子交换法、折点加氯法、生物法和吸附法等。其中，生物法适用范围广、便于操作；吸附法工艺简单，且吸附剂种类多、成本低、多数能重复利用[4]。常用的吸附材料有沸石、膨润土、粉煤灰等。生物炭作为一种新型吸附材料，制备原料来源广泛(如稻壳、玉米秸秆、牛粪、污泥等)，具有较大的比表面积，吸附能力强，国内外应用广泛[5-6]。

与吸附法相比，生物法效率较低；以生物炭为氨氮吸附材料，存在吸附饱和后的再生问题。因此，采用生物炭基微生物固定化体(以下简写为固定化体)，将生物炭的吸附性能与微生物的降解性能相结合，能更好去除水中氨氮[7]。另外，改性可提高生物炭的比表面积，增加生物炭表面官能团数量，增强生物炭对氨氮的吸附去除能力[8-10]。YU等[11]研究发现，改性核桃壳生物炭联合施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)XL-2对氨氮的去除率高于纯细菌和单独生物炭吸附。然而，以改性生物炭为载体制备的固定化体，对低浓度氨氮废水的处理效果如何，能否达标排放，鲜见报道。

因此，本研究从污水处理厂污泥中筛选一株异养硝化菌，分别以未改性稻壳生物炭(BC)、NaOH和H2O2改性BC为载体，用吸附法制备固定化体，开展生物炭和固定化体对水中低质量浓度氨氮(约10 mg/L)的去除动力学研究。

1 材料与方法

1.1 异养硝化菌的分离与鉴定

1.1.1 富集、分离和纯化

菌种来源为山西省晋中市某污水处理厂的浓缩池污泥。将2 mL污泥上清液接种至200 mL异养硝化培养基(氨氮初始质量浓度10.00 mg/L)进行富集培养(170 r/min、30 ℃)[12]，每3天按1%(体积分数)接种量将培养基上清液再次接种至相同新鲜的异养硝化培养基中，连续转接3次。然后，用平板涂布法和平板划线法分离和纯化，将分离的单菌落接种到斜面培养基上30 ℃培养48 h，即得到异养硝化菌菌株[13]。

1.1.2 生物化学和分子生物学鉴定

将分离纯化的菌株接种至异养硝化培养基(氨氮初始质量浓度9.43 mg/L)，分别于0、12、16、24、48、72 h测定培养基中氨氮，再测定氨氮降解能力最强菌株培养体系中总氮、硝态氮和亚硝态氮。本研究共筛选3株菌(N1、N2、N3)，通过其氨氮降解能力鉴定细菌的生物化学活性，选取氨氮降解能力最强的菌株进行后续研究。

采用与乔鑫[14]相同的方法，进行所选取菌株的分子生物学鉴定。将菌株序列通过BLAST检索，与GenBank中的核酸序列进行同源性比对，利用MEGA-X软件，以邻接法构建16S rDNA基因系统发育树。

1.2 固定化体的制备

1.2.1 生物炭

BC使用前过100目筛。分别用1 mol/L NaOH和10%(体积分数)H2O2制备改性BC，生物炭和改性液的比例始终为1 g∶50 mL[15]，改性时间均为12 h。将改性BC过滤，用去离子水淋洗至pH稳定，并烘干。NaOH和H2O2改性后的BC分别记为NaOH-BC和H2O2-BC。

生物炭的pH采用pH计(Mettler Toledo Delta 320)测定(炭水比例1 g∶15 mL)；表面零电荷点(pHpzc)采用滴定法测定；电导率采用数显电导率仪(雷磁DDS-307A)测定；酸碱性含氧官能团数量采用Boehm滴定法测定。

1.2.2 固定化体

从斜面培养基上挑取筛选出的菌株接种于400 mL LB液体培养基中，培养至600 nm处吸光度(OD600)为1.0(170 r/min、25 ℃)，然后将培养基分装至离心管中离心收集菌体，用无菌水洗涤两次，最后悬于20 mL无菌水中，分别加入0.2 g BC、NaOH-BC或H2O2-BC，振荡24 h(170 r/min、25 ℃)，过滤，并用无菌水淋洗，由此得到固定化体，分别记为BC+N3、NaOH-BC+N3或H2O2-BC+N3。采用磷脂法测定BC、NaOH-BC和H2O2-BC的微生物吸附量(以磷计)，磷脂在所有微生物细胞中均存在，是细胞膜的主要成分，且在细胞死亡后很快分解，是表示活菌总数的理想指标[16]。

1.3 生物炭和固定化体对水中氨氮的去除

为探究生物炭和固定化体对水中低浓度氨氮的去除效果，分别将0.2 g生物炭和固定化体加入20 mL模拟氨氮废水(具体配置参考文献[17])中。170 r/min、25 ℃下培养，定期采集水样，0.45 μm滤膜过滤后测定氨氮浓度。

为探究固定化体对水中氨氮去除的动力学规律，分别用准一级动力学方程(见式(1))和准二级动力学方程(见式(2))对实验数据进行拟合。

Qt=Qe×(1-e-K1×t)

(1)

t/Qt=1/(K2×Qe2)+t/Qe

(2)

式中：t为时间，h；Qt为t时刻氨氮去除量，mg/g；Qe为平衡时氨氮去除量，mg/g；K1为准一级动力学速率常数，h-1；K2为准二级动力学速率常数，g/(mg·h)。

1.4 数据分析

所有实验均设3个重复，使用Excel 2010对实验数据进行平均值和标准偏差的计算，使用Origin 8.5进行绘图和方程拟合，使用Statistics 22进行方差分析和多重比较。

2 结果

2.1 异养硝化菌的筛选及对氨氮的降解

由图1(a)计算可得，培养72 h，菌株N1、N2、N3对氨氮的降解率分别为52.65%、64.18%、72.02%，菌株N3比N1、N2更能有效降解氨氮。菌株N3对总氮的降解率为51.47%，硝态氮和亚硝态氮浓度在培养过程中无明显变化，均保持在较低水平，硝态氮、亚硝态氮最高分别为0.627、0.027 mg/L(见图1(b))。选择菌株N3为目标菌株制备固定化体。

与GenBank中的核酸序列进行同源性比对，结果见图2。该菌株与恶臭假单胞菌(DQ060242)、恶臭假单胞菌SNSK 589(MG584872)和恶臭假单胞菌(KC189961)的进化距离较近，相似性分别为99.93%、99.86%和99.86%，从而确定菌株N3为恶臭假单胞菌，命名为恶臭假单胞菌N3(MN602471)。

2.2 改性对BC性质的影响

由表1可见，与BC相比，NaOH-BC的pH和pHpzc分别增大1.76和1.61，微生物吸附量增加129.77 nmol/g；H2O2-BC的pH和pHpzc分别减小1.66和1.73，微生物吸附量减少86.52 nmol/g。除内酯基外，改性前后BC各含氧官能团指标均显著变化。

2.3 固定化体去除水中氨氮的过程

由图3(a)可见，BC+N3和NaOH-BC+N3处理中，氨氮分别由最初的12.53、12.50 mg/L降至48 h时的1.39、1.37 mg/L，均低于GB 3838—2002中氨氮Ⅳ类限值(1.5 mg/L)；H2O2-BC+N3处理中，氨氮由最初的14.03 mg/L降至48 h时的2.76 mg/L，高于Ⅳ类限值。0～<12 h时，NaOH-BC+N3处理的氨氮明显低于BC+N3，但12～48 h时两个处理氨氮差别不大；0～<5、>12～48 h时，H2O2-BC+N3处理的氨氮总体高于BC+N3，5～12 h时明显低于BC+N3。

图1 氨氮降解过程中总氮、氨氮、硝态氮和亚硝态氮的变化Fig.1 Changes of total nitrogen，ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen during ammonia nitrogen degradation

图2 菌株N3的16S rDNA序列系统发育树Fig.2 16S rDNA sequence phylogenetic tree of strain N3

表1 改性前后BC的基本性质1)

由图3(b)可见，3种处理中，BC+N3、NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3处理的氨氮去除速率均在0～10 min快速增加到最大值，最大值分别为16.54、22.26、15.24 mg/(L·h)；10 min后迅速降低，5～48 h趋于平缓。

生物炭对氨氮的吸附在8 h达到平衡。总体上，培养初期，固定化体对氨氮的去除率低于生物炭，随培养时间延长，固定化体对氨氮的去除率逐渐升高，并最终高于生物炭处理。培养12 h，BC+N3的氨氮去除率(85.66%)高于BC(49.30%)；培养1 h，NaOH-BC+N3的氨氮去除率(45.09%)高于NaOH-BC(43.00%)；培养5 h，H2O2-BC+N3的氨氮去除率(59.91%)高于H2O2-BC(37.06%)。培养48 h，BC+N3、NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3对氨氮的去除率(88.94%、89.08%、79.00%)均高于相应生物炭(8 h时BC、NaOH-BC和H2O2-BC分别为49.30%、53.51%和36.57%)；与改性前相比，改性固定化体更利于恶臭假单胞菌N3(MN602471)活性恢复与氨氮去除。

2.4 固定化体去除水中氨氮的动力学拟合

各处理的准二级动力学方程的R2均大于准一级动力学(见表2)；根据准二级动力学方程计算的Qe与实测值(BC+N3、NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3处理分别为1.11、1.11、1.13 mg/g)较接近。因此，准二级动力学方程能更好描述固定化体对氨氮的去除过程。NaOH-BC+N3处理的准二级动力学方程R2和K2均大于BC+N3、H2O2-BC+N3处理，表明NaOH改性固定化体对水中低浓度氨氮的去除能力最强，去除速率最大。

图3 固定化体去除氨氮过程中氨氮质量浓度和去除速率的变化Fig.3 Changes of ammonia nitrogen mass concentration and removal rate during the removal of ammonia nitrogen by biochar-based microbial immobilization body

表2 固定化体去除水中氨氮的动力学拟合参数

3 讨论

3.1 生物炭性质对固定化体去除氨氮的影响

与BC相比，NaOH-BC的pH显著升高，主要原因为改性过程中NaOH中和了生物炭表面较多的酸性含氧官能团，使总酸性含氧官能团显著减少、总碱性含氧官能团显著增加；H2O2-BC的pH显著降低，主要由于H2O2是一种强氧化性弱酸，可中和生物炭表面部分碱性含氧官能团，并使总酸性含氧官能团显著增加、总碱性含氧官能团显著减少。

与BC相比，NaOH-BC的pHpzc显著增大，H2O2-BC的pHpzc显著减小，主要由于NaOH改性显著减少了生物炭表面羧基数量(比BC减少7.90%)，而H2O2改性显著增加了生物炭表面羧基数量(比BC增加12.61%)，同时酸性含氧官能团是pHpzc的主控因素[18]。生物炭的pHpzc是影响生物炭微生物吸附量的重要指标，主要由于其可改变生物炭和微生物之间的静电引力。生物炭表面电荷的正负性与生物炭的pHpzc、溶液的pH有关[19]。NaOH-BC的pHpzc(8.74)大于模拟废水pH(7.00)，故其表面带正电荷，而大多数细菌的pHpzc(3～4)小于模拟废水pH，故细菌表面带负电荷，因此细菌在静电引力作用下易附着在NaOH-BC上。然而，H2O2-BC的pHpzc(5.40)小于模拟废水pH，故其表面带负电荷，与带负电荷的微生物之间的静电斥力不利于吸附微生物。另外，H2O2-BC表面较多的酸性含氧官能团对微生物活性有一定抑制作用[20]。因此，NaOH-BC的微生物吸附量显著大于H2O2-BC。

3.2 固定化体去除氨氮的过程分析

固定化体去除氨氮的过程可分为氨氮迅速降低和趋于平缓两个阶段。在培养初期，生物炭吸附起主要作用，生物炭将氨氮吸附到其表面或孔隙中，氨氮浓度在短时间内急剧降低；随着培养的进行，微生物降解发挥作用，异养硝化菌与生物炭吸附的氨氮直接接触，并利用废水中的碳源降解氨氮，使氨氮浓度逐渐降低。吸附与降解的协同作用使废水中的氨氮浓度达到平衡，这一过程符合WANG等[21]提出的固定化细菌吸附协同生物降解假说模型。

BC+N3、NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3对氨氮的去除率分别在12、1、5 h后才分别高于相应生物炭处理，表明与生物炭吸附相比，培养初期固定化体对氨氮的去除率较低，其原因可能为生物炭固定的恶臭假单胞菌N3对氨氮起降解作用需要一定的时间。固定化体的氨氮去除率(48 h)远高于生物炭吸附平衡时(8 h)的氨氮去除率，表明固定化体的吸附协同生物降解作用比生物炭的吸附作用更高效、彻底[22]。与BC+N3相比，NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3处理的氨氮去除率超过相应生物炭处理所需时间较短，表明以改性生物炭为载体制备的固定化体更利于微生物发挥其降解作用，尤其是NaOH改性固定化体。其主要原因：(1)NaOH对生物炭有一定清洗作用，可清洗生物炭表面和孔隙中堵塞的灰分，增加生物炭比表面积，从而利于吸附固定微生物[23]。与BC和H2O2-BC相比，NaOH-BC的微生物吸附量最高(423.31 nmol/g)，而氨氧化微生物是氨氮去除的主要参与者[24]。(2)与BC和H2O2-BC相比，NaOH-BC的pH最高(9.74)，由于氨氧化过程会消耗碱度，投加NaOH-BC可补充水中碱度，进而促进氨氧化作用，提高氨氮去除率[25]。

固定化体对氨氮的去除过程更符合准二级动力学。固定化体对氨氮的去除由多个过程控制。生物炭表面丰富的官能团和内部孔隙结构，对氨氮吸附均有贡献。在氨氮从水相向生物炭迁移过程中，经历了水膜扩散、生物炭颗粒表面扩散和颗粒内部微孔扩散等多个过程；氨氮被生物炭吸附后，负载在生物炭上的微生物以氨氮为氮源，在酶促作用下将其分解[26]。