桑抹茶对THP-1 源性泡沫细胞脂质沉积作用的实验研究

王 英 朱发伟 楼招欢

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是冠心病等心脑血管病的关键病理基础，脂质代谢异常是AS 发生发展的主要诱因[1]。胆固醇酯在巨噬细胞内过度堆积形成泡沫细胞是AS 的典型病理特征[2]，减少脂质在动脉管壁的沉积，能有效阻止AS 的发生发展。已知桑叶水提取物[3]、桑叶总黄酮[4]能有效减少脂肪积累，促进胆固醇代谢，预防AS 的发生发展。课题组前期研究结果显示，由新鲜桑叶经特殊工艺制成的桑抹茶能有效降低高脂血症模型大鼠血清胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平，提高血清高密度脂蛋白（HDL-C）水平，降低动脉硬化指数，上调高脂血症模型大鼠胸主动脉肝X 受体α（LXRα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）表达，改善血管病理改变[5]。提示桑抹茶可能通过促进胆固醇从动脉壁细胞流出，减少细胞内脂质沉积，发挥防治AS 作用[6]。本文拟在此基础上，通过佛波酯诱导的THP-1 泡沫细胞模型[7-8]，观察桑抹茶对巨噬细胞胆固醇摄取及沉积的作用，探讨桑抹茶抗AS 的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株 THP-1 细胞（批号SCSP-567，中国科学院细胞库）。

1.2 药 物 桑抹茶（批号20180809，杭州沃亚生物科技有限公司），桑抹茶加10BV 水超声30min，离心，取上清，重复2 次；减压浓缩，冻干，即得。

1.3 试 剂 佛波肉荳蔻醋酸（PMA，5mg/mL，批号50601ES02，上海翊圣生物科技有限公司）；人源氧化低密度脂蛋白（Human Ox-LDL，2mg/mL，批号20605ES05），人源红色荧光标记氧化型低密度脂蛋白（Human Dil-Ox-LDL，500μg，批号609ES76），均购自上海翊圣生物科技有限公司；RPMI1640 培养基（批号GNM-31800S，杭州吉诺生物）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，批号ST1537，碧云天）；总胆固醇（T-CHO）检测试剂盒（批号A111-1，南京建成）；油红O 染料（批号WSIG0100803，国药集团化学试剂有限公司）；PPARγ 抗体（批号YM3443，ImmunoWay）、腺苷三磷酸结合盒转运体A1（ABCA1）抗体（批号bs-1627R，博奥森）。

1.4 仪 器 BA410 生物显微镜、Adavance 3.2 图像分析系统（Motic 公司），Ti-S、EVOS FL 荧光倒置显微镜（尼康），Milli-Q Synthesis A10 纯水仪（美国MILLIPORE 公司），Power Wave 340 酶标仪（美国Bio-TeR）。

2 实验方法

2.1 THP-1 源性泡沫细胞模型制备 THP-1 单核细胞生长于含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中，37℃、5% CO2培养箱中静置培养。每48～72h传代1 次。取对数生长期细胞进行实验，以1×105cell/mL 点96 孔板，每孔200μL 体积，实验前用160nmol/L 佛波酯孵育THP-1 单核细胞24h，使其诱导分化成巨噬细胞。待其贴壁生长融合至80%左右，换含0.3% BSA 的无血清培养液培养，给予50μg/mL Ox-LDL 处理48h。

2.2 MTT 法检测桑抹茶对THP-1 源性泡沫细胞增殖活力的影响 实验分为正常对照组：佛波酯诱导的THP-1 源性巨噬细胞，模型对照组：佛波酯+Ox-LDL 诱导的THP-1 源性泡沫细胞；药物干预组：THP-1 源性泡沫细胞+不同浓度（10、20、40、80、160、320、640μg/mL）桑抹茶提取物；同时设RPMI 1640培养基为空白对照。药物干预组培养液中加入不同浓度桑抹茶水提物干预24h，其余各组加入培养基干预24 后，加20μL MTT 孵育4h，加入DMSO 150μL震荡10min，于570nm 处测定吸光度A570，以对照组调零，细胞存活率=（加药组平均A 值/正常对照组平均A 值）×100%。

2.3 油红O 染色观察细胞内脂质沉积 将THP-1细胞培养于放有盖玻片的6 孔培养板内，细胞被诱导分化为巨噬细胞后贴壁生长于培养板。换含0.3%BSA 的无血清培养基培养3h，再予以高、中、低浓度的桑抹茶提取物（93、186、372μg/mL）处理24h 后加入Human Ox-LDL，使其终浓度为20μg/mL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养6h 后，用PBS 液冲洗3次，每次5min；4%多聚甲醛固定10min，油红O 染色液染色10min，弃上清，60%异丙醇清洗1 次，再用PBS 洗涤3 次，显微镜观察并拍照。采用Image J 1.46r（Wayne Rasband National Institutes of Health，USA）图像分析系统对油红O 染色结果进行半定量分析。

2.4 荧光显微镜下观察THP-1 源性巨噬细胞内吞Ox-LDL 的变化 取THP-1 细胞，分为THP-1 源性泡沫细胞组、THP-1 源性泡沫细胞+不同浓度桑抹茶提取物作用组（93、186、372μg/mL）；将THP-1 细胞培养于放有盖玻片的6 孔培养板内，细胞被诱导分化为巨噬细胞后贴壁生长于培养板。换含0.3%BSA的无血清培养基培养3h，再予以不同浓度的桑抹茶提取物（93、186、372μg/mL）处理24h，然后加入Human Dil-Ox-LDL，使其终浓度为20μg/mL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养6h，PBS 洗涤3 次，荧光显微镜下观察拍照。

2.5 Western blot 法检测PPARγ、ABCA1 蛋白表达水平 实验分组及处理同“2.3”。收集各组细胞，用预冷的PBS 缓冲液洗涤3 次，按细胞膜蛋白抽提试剂盒提取膜蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。50μg 膜蛋白样品与上样缓冲液按比例混合后煮沸5min，SDS-PAGE 电泳，WB 湿法转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2h，TBST 漂洗3 次后分别加入一抗和GAPDH，4℃孵育过夜，TBST 漂洗3 次，37℃二抗反应2h，进行ECL 显色。以GAPDH 为内参，计算各处理组目的蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法 应用SPSS 16.0 统计软件分析数据，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，两组间比较采用t-test，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 桑抹茶对THP-1 源性泡沫细胞增殖活力的影响 细胞增殖活力检测结果显示（见表1），在10～160μg/mL 范围内，随着浓度的增加，桑抹茶提取物对THP-1 源性巨噬细胞活性的抑制作用逐渐增强（P＜0.05），至200μg/mL 后相对平缓；桑抹茶提取物对THP-1 源性巨噬细胞抑制作用的IC50 为186.7μg/mL。

3.2 桑抹茶对THP-1 泡沫细胞内脂质沉积的影响图1 结果显示，与未经Ox-LDL 处理的细胞相比，佛波酯+Ox-LDL 处理的THP-1 源性巨噬细胞内脂质沉积（红染）明显，提示泡沫细胞形成；桑抹茶提取物呈浓度依赖性地降低THP-1 泡沫细胞脂质沉积程度（P＜0.01），见表2。

表1 各组细胞活力比较（%）

表1 各组细胞活力比较（%）

注：Ox-LDL 为氧化低密度脂蛋白；与对照组比较，aP＜0.05；与Ox-LDL模型组比较，bP＜0.05

表2 各组细胞内脂质水平比较（IOD/Area）

表2 各组细胞内脂质水平比较（IOD/Area）

注：Ox-LDL 为氧化低密度脂蛋白；与对照组比较，aP＜0.01；与Ox-LDL模型组比较，bP＜0.01；与Ox-LDL+桑抹茶93μg/mL 组比较，cP＜0.05；n为实验次数

3.3 桑抹茶对THP-1 源性巨噬细胞内吞Ox-LDL的影响 荧光显微镜观察结果显示，给予桑抹茶提取物预处理，能浓度依赖地抑制THP-1 源性泡沫细胞对Ox-LDL 的摄取，减少细胞内脂质沉积，见图2。

图1 桑抹茶提取物对THP-1 源性巨噬细胞内脂质沉积的影响（油红O 染色×200）

图2 桑抹茶提取物对THP-1 源性巨噬细胞内吞Ox-LDL 的变化（×200）

3.4 桑抹茶对THP-1 泡沫细胞PPARγ、ABCA1 蛋白表达水平的影响 Western blot 结果显示，与对照组比较，THP-1 泡沫细胞ABCA1 蛋白表达增加，PPARγ 蛋白表达水平显著降低；与模型组比较，桑抹茶提取物能浓度依赖地增加THP-1 源性泡沫细胞ABCA1、PPARγ 蛋白表达水平（P＜0.01），见图3，表3。

图3 各组细胞ABCA1、PPARγ 蛋白表达

表3 各组细胞ABCA1、PPARγ 蛋白表达量比较（）

表3 各组细胞ABCA1、PPARγ 蛋白表达量比较（）

注：Ox-LDL 为氧化低密度脂蛋白；ABCA1 为腺苷三磷酸结合盒转运体A1；PPARγ 为过氧化物酶体增殖物激活受体γ；n 为实验次数；与对照组比较，aP＜0.01；与Ox-LDL 模型组比较，bP＜0.01；与Ox-LDL+桑抹茶93μg/mL 组比较，cP＜0.01；与Ox-LDL+桑抹茶186μg/mL 组比较，dP＜0.01

4 讨论

已知血脂代谢异常是动脉粥样硬化的重要诱因。由异常升高的低密度脂蛋白（LDL）氧化修饰形成的氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）侵入并沉积于血管内膜，损伤内皮细胞，触发炎症反应；而由单核细胞黏附并活化的巨噬细胞通过清道夫受体CD36 和A 类1 型清道夫受体（SR-AI）吞噬Ox-LDL 形成泡沫细胞，促进AS 发生发展[9-10]。稳定的泡沫细胞模型对AS 发生发展及药物干预作用机制研究至关重要。人源THP-1 和鼠源RAW264.7 巨噬细胞是Ox-LDL 诱导的泡沫细胞常用的两种巨噬细胞[11]，其中Ox-LDL 诱导的THP-1巨噬细胞泡沫细胞模型常应用于细胞脂质代谢异常[12]、凋亡[13]等的研究。本研究结果显示，Ox-LDL 处理的THP-1 源性巨噬细胞内红色脂质明显增多，表明泡沫细胞形成；予以桑抹茶提取物干预，能有效减少Ox-LDL 的摄取，降低THP-1 泡沫细胞内脂质沉积。提示桑抹茶可能具有预防AS 发生的作用。

胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）是血脂代谢的中心环节[14]，外周组织ABCA1 和三磷酸腺苷结合腺联（ABCG1）介导细胞胆固醇外流[15]，是RCT 的起始步骤。血管中的ABCA1 可经PPARα/γ-LXRα-ABCA1 正向调控表达[16]；在胆固醇逆转运蛋白载脂蛋白（ApoE）、ABCA1 等作用下，胆固醇可从细胞内流向细胞膜并转运至细胞外[17]，能有效减少胆固醇在血管壁的堆积，阻断AS 的发生发展[18]。PPARγ 通过降低清道夫受体（SR-A）的表达、增强CLA/SR-BI、ABCA1 等的表达，促进细胞内胆固醇流出，负调控泡沫细胞形成[19-20]。已知Ox-LDL 能诱导THP-1 巨噬细胞分泌白介素（IL）-10、IL-1β 等炎症因子，诱发炎症反应[11]；AS 早期，PPARγ 表达上调能抑制血管壁单核/巨噬细胞介导的炎症反应，阻断AS的进展[21]。课题组前期在桑抹茶抗高脂血症作用研究中发现，给予桑抹茶干预，能促进高脂血症模型大鼠胸主动脉血管LXRα、PPARγ 表达水平，改善血管病变[7]。本研究结果也证实，桑抹茶提取物能增加THP-1 源性巨噬细胞胆固醇逆转运蛋白ABCA1 及PPARγ 的表达，减少细胞内脂质沉积。提示桑抹茶可能可以通过抑制血管壁巨噬细胞胆固醇沉积，促进胆固醇从细胞壁流出，改善Ox-LDL 诱导的炎症反应，阻断AS 的发生发展。