理气通便合剂对便秘型肠易激综合征模型大鼠结肠、下丘脑组织5-HT、VIP 的影响

2021-03-04施琳琳詹程胹陶丽媛陈冻伢

浙江中西医结合杂志 2021年2期

陈芳施琳琳王峻詹程胹刘敏陶丽媛陈冻伢

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是临床常见的功能性胃肠病[1]。研究显示，IBS 发病机制包括内脏高敏感、肠道动力异常、精神心理因素、肠道感染和肠黏膜屏障功能异常等[2-3]。罗马Ⅳ指南指出IBS 患者存在肠-脑互动异常，脑肠肽在其中扮演了非常重要的角色[4]。5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）作为重要的旁分泌信使和神经递质，参与IBS 内脏高敏感、肠道动力异常等多种病理过程的发生。理气通便合剂是浙江省中西医结合医院在长期临床治疗便秘型肠易激综合征（constipationpredominant irritable bowel syndrome，IBS-C）实践中总结出的有效方剂。本研究组观察其对IBS-C 模型大鼠5-HT、VIP 的影响，探讨理气通便合剂治疗IBS-C 的可能作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 SPF 级SD 大鼠24 只，雌雄各半，体质量（140±20）g，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司。动物合格证号：SYXK（浙）2018-0012，饲养于浙江中医药大学动物实验中心，饲养环境为室温21℃、湿度70%、噪音＜50dB，每笼4 只，自由饮水、摄食。本实验经浙江中医药大学伦理委员会审批通过（批准编号：IACUC-20180326-12）。

1.2 药物理气通便合剂由生白术12g，黄芪30g，生首乌6g，炒枳实、槟榔、藿香各10g，炒莱菔子12g 组成，药物由浙江省中西医结合医院中药房提供，经浸泡、2 次煎煮、过滤、浓缩至1g/mL，于4℃冰箱保存，用前加温至37℃。枸橼酸莫沙必利片5mg/片，日本制药株式会社生产，将药片碾碎后溶于生理盐水，浓度为0.135%，4℃冰箱保存，用前加温。

1.3 试剂与仪器大鼠5-HT、VIP 的酶联免疫检测试剂盒，批号分别为HR3238483-1、HR3452158-1，购自上海酶联生物科技有限公司；酶标分析仪：Rayto RT-6100。

2 实验方法

2.1 分组、造模与给药 24 只SD 大鼠适应性喂养1 周后，以随机数字表法分为空白组、IBS-C 模型组、理气通便合剂组、莫沙必利组，每组6 只。采用冰水灌胃法[5]制备大鼠IBS-C 模型，用0～4℃冰水2mL/只每天灌胃1 次，连续灌胃21 天；空白组予2mL/只常温生理盐水灌胃。通过观察大鼠粪便Bristol 分型对模型进行评价[4]；即1 型坚果状硬球，2 型硬结状腊肠样，3 型腊肠样、表面有裂缝，4 型表面光滑、柔软腊肠样，5 型软团状，6 型糊状便，7 型水样便。

根据人与动物间按体表面积折算的等效剂量换算法计算药物干预剂量[6]。灌胃第8 天起理气通便合剂组予加用理气通便合剂（18.75g·kg-1·d-1）灌胃，莫沙必利组予莫沙必利水溶液（1.35mg·kg-1·d-1）灌胃，空白组及IBS-C 模型组予等量生理盐水灌胃。

2.2 标本取材药物干预治疗14 天后，禁食24h，不限水，以10%水合氯醛予腹腔注射麻醉后，开腹，迅速取出各组大鼠距肛门6cm 的结肠2.0cm，在冰盘上分离大鼠少量下丘脑组织，存放于1.5mL 冻存管内，置于液氮，以备酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 大鼠一般情况观察食欲、精神状态、活动情况、大便性状及体质量情况等。

2.3.2 大鼠结肠HE 染色情况将石蜡标本连续切片（厚度约4μm），HE 染色后，光学显微镜观察大鼠结肠黏膜结构与形态。

2.3.3 大鼠结肠、下丘脑5-HT、VIP 蛋白ELISA 检测用预冷的PBS 冲洗组织，将组织剪碎后匀浆，后将匀浆液离心，取上清液进行ELISA 检测，操作严格按照说明书进行。

2.4 统计学方法应用SPSS 21.0 软件对数据信息进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠一般情况造模期间，无大鼠死亡。空白组大鼠精神状态活跃，背毛光泽，Bristol 分型呈3型；IBS-C 模型组大鼠精神状态不佳，背毛光泽度差，进食量少，粪质干硬，Bristol 分型呈1～2 型。14 天给药治疗结束后，理气通便合剂组和莫沙必利组大鼠精神状态好转，背毛光泽，进食量多，粪便Bristol分型呈3～4 型。

图1 各组大鼠结肠黏膜病理图片（HE ×200）

3.2 各组大鼠结肠组织病理学观察 HE 染色显示，理气通便合剂组与莫沙必利组大鼠结肠黏膜腺体排列整齐，黏膜可见少许充血水肿，无明显黏膜糜烂及溃疡，炎性细胞浸润较少，镜下表现与空白组较为接近；IBS-C 模型组大鼠结肠黏膜病理显示黏膜腺体排列欠整齐，黏膜层可见有中性粒细胞浸润，且肌层有断裂现象，与空白组差异较大。见图1。

3.3 各组大鼠结肠、下丘脑组织5-HT、VIP 蛋白表达量比较与空白组比较，IBS-C 模型大鼠结肠、下丘脑组织5-HT、VIP 表达量增高（P 均＜0.05）；与IBS-C 模型组比较，莫沙必利组、理气通便合剂组大鼠结肠、下丘脑组织5-HT 表达量降低（P 均＜0.05）；理气通便合剂组大鼠结肠、下丘脑组织VIP 表达量低于IBS-C 模型组（P＜0.05），见表1-2。

表1 各组大鼠结肠组织5-HT、VIP 表达水平比较（）

注：空白组予2mL/只生理盐水灌胃；IBS-C 模型组予冰水2mL/只灌胃；莫沙必利组在造模基础上予莫沙必利水溶液（1.35mg·kg-1·d-1）灌胃；理气通便合剂组在造模基础上予理气通便合剂（18.75g·kg-1·d-1）灌胃；IBS-C 为便秘型肠易激综合征；5-HT 为5-羟色胺；VIP 为血管活性肠肽；与空白组比较，aP＜0.05；与IBS-C 模型组比较，bP＜0.05

4 讨论

IBS 是一种以排便习惯改变伴有腹痛为特征的功能性肠道疾病，根据排便习惯改变，可表现为便秘型（IBS-C）、腹泻型（IBS-D），或便秘与腹泻交替型（IBS-M）。近年来，中枢神经系统（CNS）-肠神经系统（ENS）所构成的脑-肠轴互动异常在IBS 发病机制中的作用越来越受到重视。脑肠肽由胃肠道内分泌细胞分泌，在神经系统及胃肠均有分布，具有胃肠激素、神经递质、神经调质等功能的小分子肽类物质，可参与内脏感觉、胃肠道运动和分泌等生理过程的调控。

表2 各组大鼠下丘脑组织5-HT、VIP 表达水平比较（）

由于脑肠轴的存在，CNS、ENS 可以独立或协同地对肠道运动、分泌、内脏感觉传导等功能进行调控。其中，5-HT 占有非常重要的地位[7]。由于缺乏内在或外在的神经纤维到达黏膜上皮层，而ENS 对胃肠道的调控作用需要其感受到肠腔内压力和化学刺激因素，因此，神经元感受肠腔内刺激是一种经过上皮黏膜传导的机制[8-9]。肠嗜铬细胞感受到肠腔内容积或压力刺激后释放大量5-HT，随之激活黏膜下层初级传入神经元，后者在黏膜下层或肌层的肌间神经丛中与上行或下行中间神经元形成突触，通过释放某些神经递质，从而调节局部的兴奋和抑制[8]。上行性中间神经元释放P 物质、乙酰胆碱（Ach）等物质作用于运动神经元，引起环行肌兴奋收缩；下行性中间神经元释放5-HT、VIP、NO、Ach 等神经递质，引起环行肌松弛；由此形成了胃肠道由节律的收缩与松弛，形成蠕动反射[10-11]。同时，CNS 参与的外源性信号通路也共同参与其中，除了调节肠蠕动，在内脏感觉传导中也发挥了重要作用。但CNS 对ENS 的调控，目前仍缺乏文献报道。本研究结果显示，CNS 及ENS 存在5-HT、VIP 等胃肠激素的同步变化，提示这些胃肠激素可能是发挥调控作用的效应因子。

5-HT 受体存在多种受体亚型。研究表明，参与蠕动反射的主要为5-HT4 受体[12]。目前已有多种药物就是基于5-HT 信号系统而被设计出来调节胃肠道的运动，分泌和感觉。包括替加色罗，一种5-HT4部分激动剂，已被批准用于治疗女性IBS-C 模型组，以及慢性便秘。5-HT3 受体拮抗剂格拉司琼和昂丹司琼可用于对抗与癌症化学疗法相关的恶心，而阿洛司琼用于治疗IBS-D。本研究结果显示，IBS-C 大鼠结肠及下丘脑组织5-HT、VIP 浓度均较空白组有所升高；理气通便合剂干预后，无论结肠还是下丘脑5-HT、VIP 均有下降（P 均＜0.05）。我们推测5-HT、VIP 可能在CNS、ENS 水平对IBS-C 的运动及感觉功能进行调控，同时也是理气通便合剂发挥作用的一个分子靶标，但具体机制仍待进一步研究。

IBS-C 属中医“便秘”范畴，其主要病机为大肠传导失司，同时又与肝、脾、胃、大肠等脏腑功能失调密切相关，尤其与肝的条达疏泄息息相关。因此在治疗上以“理气疏肝，润肠通便”为治则。我院自行组方研制理气通便合剂，方中以白术健脾益气利水，黄芪补脾益气，枳实破气消积除痞，莱菔子行气消食除胀，槟榔苦温行气，生首乌润肠通便，藿香芳香化湿，诸药合用起到理气健脾、通达六腑的作用。目前该方在临床上对功能性便秘及危重患者腹腔高压等疗效确切[13-14]。

综上所述，理气通便合剂能改善IBS-C 模型大鼠的精神状态、进食量和便秘症状；5-HT、VIP 可能在CNS、ENS 水平对IBS-C 的运动及感觉功能进行调控，同时也可能是理气通便合剂发挥作用的分子靶标。