7个接骨木无性系苗木对盐胁迫的生理响应与评价

刘学良，姚俊修，刘翠兰，李善文，任 飞，李庆华，吴海涛，翟红莲，吴德军，邢世岩，高红萍

（1.山东农业大学 林学院，山东 泰安 271018；2.山东省林业科学研究院 山东省林木遗传改良重点实验室，山东 济南 250014；3.山东博华高效农业生态有限公司，山东 滨州 256500；4.吉林省大安市四棵树乡政府林业站，吉林 大安 137000）

接骨木Sambucus williamsii系忍冬科Caprifoliaceae接骨木属Sambucus落叶灌木或小乔木。接骨木的果实含油量丰富，且油质较好，在我国大力倡导发展的新型木本油料树种中具有很大的开发价值。接骨木在抗炎、镇痛、促进骨折愈合、抗骨质疏松、增强免疫活性、提高学习记忆力、降血脂、软化血管等方面具有一定的药用价值。接骨木根系发达，萌蘖性强，较耐旱，耐寒，广泛分布于北至黑龙江，南至广东的我国各地区[1-3]。目前，部分地区正将接骨木作为荒山绿化树种，成效显著且价格低廉。

土壤盐渍化治理是世界性难题。其中，干旱、半干旱地区尤为严重。据有关部门不完全统计，全世界盐渍土地面积约为9.54 亿hm2[4]，从沿海到内陆，随着工业的发展，环境的污染越来越严重[5]，土壤的盐渍化已成为制约我国灌溉农业可持续发展的重要因素[6]。盐渍化主要是因为土壤中含有大量NaCl 等中性可溶性盐导致，当土壤中可溶性盐达到一定含量时，会破坏土壤结构，导致土壤物理指标发生严重恶化[7]。植物根系在吸收土壤中营养元素时，将大量盐分一起吸收，导致植物细胞中渗透压、酶活性等生理生化指标发生变化，从而对植物产生显著危害，甚至导致死亡。在植物的发展进化中也产生了一些抵抗机制来避开盐害胁迫。根部通过选择性吸收无机离子，植物体系统统调节渗透压，调节体内各物质的含量，各种酶活性，调节根、茎、叶的生理、形态等指标等方式来提高耐盐性[8]。通过查阅文献，目前对接骨木属树种的研究仅局限于资源概述[9]、药用及油用研究[3,10]、栽培模式、无性繁殖及分子标记开发等方面[11-13]，而对接骨木不同种无性系耐盐性相关研究未见报道，因接骨木具有易繁殖、抗干旱、耐瘠薄等特点，对其耐盐性进行研究，旨在为盐碱地、瘠薄山地等困难造林地提供良种，对于盐碱地等困难立地的生态建设起到显著的示范和促进作用。鉴于此，本研究对3 个不同种接骨木（接骨木Sambucus williamsii；西洋接骨木Sambucus nigra；金叶接骨木Sambucus canadensis‘Aurea’）的7 个无性系在受到NaCl 盐胁迫产生生长生理等指标的变化，并对相关指标进行综合评价，从而初步确定不同种接骨木的耐盐能力，进一步丰富盐碱地造林材料。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验于山东省滨州市博兴县山东博华高效生态农业科技有限公司进行。滨州博兴县位于118°04′～118°22′E、36°58′～37°27′N 之间，属典型的温带季风型大陆性气候，光照充足，雨水丰盈，气候宜人。年平均降水量601 mm，无霜期180 d。年平均气温12.5℃，全年日照时数2 595 h，可满足农作物光照和热量需要。

1.2 试验材料

2017年2月中旬从山东各地取接骨木优株（优株树龄20 a 左右）当年生粗细相近枝条作插穗进行扦插，试验采用接骨木属3 个种7 个无性系（表1）于山东省滨州市博兴县博华高效农业科技有限公司基地扦插于35 cm×30 cm 的塑料花盆中，每盆扦插1 穗，每无性系扦插60 盆。扦插基质由普通土壤和草炭土1:1 混合均匀而成，其土壤理化性质为：有机质含量37.40 g/kg，有效氮200.07 mg/kg，有效磷420.31 mg/kg，有效钾653.95 mg/kg，土壤pH 值7.58，含盐量为2.45‰。田间最大持水量59.9%，每盆土壤干质量10 kg。

表1 试验材料Table 1 Experimental materials

1.3 研究方法

2017年7月20日从接骨木无性系生长量基本一致的苗木中选取16 株参与试验，整个试验在人工搭建的遮雨棚下进行，以避免外界雨水干扰。试验设计4 个处理，每处理4 次重复[14]；首先将试验所用苗木充分灌溉，经过控水处理，使得每盆的含水量相对一致，再分别用0‰（T0：对照）、2‰（T1）、4‰（T2）、6‰（T3）4 个 不同浓度的NaCl 溶液进行胁迫处理。试验开始后每次每盆浇盐溶液500 mL，4～5 d 浇盐溶液一次。盆底部垫有花盆托和20 cm 高的块砖。每天下午将花盆托中的渗出液体倒回盆中，采用称重法对每盆苗木进行补水，确保土壤相对含水量维持在75%～80%。盐胁迫处理时间44 d，当盐胁迫达到一定浓度后，观察植株变化，陆续取样测定各指标，总实验周期在100 d 左右。采样时土壤最终盐分状况如表2所示。取样时，每植株均剪取中部健壮枝条从顶端数第3、4 个复叶叶片进行生理生化指标的测定，每次每个测定指标重复测定3次。

表2 土壤相对含盐量Table 2 Relative salt content of soil

1.4 测定指标

1.4.1 生长指标的测定

试验初始，用5 m 卷尺和游标卡尺对所有参与试验的苗木进行株高H0和地径B0的测定。试验结束后，再次测定所有接骨木试验苗的苗高H1和地径B1。分别计算苗高增量（H1-H0）和地径增量（B1-B0）。

生物量和根冠比的测定：试验开始时，在不同或者相同无性系中选取3 株生长势较为平均的完整植株，用去离子水清洗植株的根、茎、叶上的杂质并擦干后于105℃下烘干至恒质量，测定每株无性系的生物量，取其平均值为生物量1。试验结束后，在不同无性系中分别选取3 株生长势较为平均的完整植株，用去离子水清洗植株的根、茎、叶上的杂质并用吸水纸快速吸干后于105℃下烘干至恒质量，测定每株无性系的生物量，不同无性系平均值均设定为生物量2。计算不同无性系生物量增量（生物量2-生物量1），根冠比为试验结束后所测根冠比。

1.4.2 生理指标的测定

Key word: ice and snow tourism; ice and snow tourism culture; ice and snow tourism resources

通过计算相对电导率得出其细胞膜透性，叶绿素含量由乙醇萃取法测定，由氮蓝四唑（NBT）光还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，可溶性糖含量由蒽酮光度法测定，脯氨酸（Pro）含量由茚三酮反应显色法检测[15]。

1.4.3 数据处理

运用Excel 2016 软件进行数据整理和图表绘制，运用SPSS 21.0 软件进行数据的单因素方差分析、Duncan’s 法进行多重比较和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期高增长量的影响

在NaCl 胁迫下，7 个接骨木无性系的苗高增长量表现出下降的趋势（图1）。NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期高生长抑制明显，其苗高增长量随NaCl 胁迫浓度的增加而减小。本试验JY-1、XY-1、XY-3 和XY-2 在4 种环境处理下苗高增长量 是PT-2、PT-3 和PT-1 的1.5～2.0 倍。在T3浓度时，无性系XY-2 是PT-2 的3.3 倍。较对照T0，无性系XY-2 的降幅最小，仅为14.9%，表现较强耐盐性。

图1 NaCl 胁迫对苗高增长量的影响Fig.1 Effect of NaCl stress on growth of height

2.2 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期地径增长量的影响

随着NaCl 溶液浓度的增加，7 个接骨木无性系地径增长量均出现不同程度的下降趋势（图2）。NaCl 溶液会抑制植物的生长，其地径增长量受抑制是主要表现方面之一。在T2和T3的处理胁迫下，XY-3 和XY-2 无性系的地径增长量最大，说明这2个接骨木无性系受NaCl 盐分胁迫抑制较轻。

图2 NaCl 胁迫对地径增长量的影响Fig.2 Effect of NaCl stress on ground diameter increment

2.3 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期根冠比的影响

低浓度NaCl 盐溶液对植物根系的生长有促进作用，而高浓度NaCl 盐胁迫对地上器官的伤害大于对地下部位的伤害程度（图3）。本试验中，在4 个处理环境下，较对照T0，接骨木无性系PT-2 的根冠比始终是最大的，变化幅度最大的接骨木无性系是JY-1 和XY-3，增幅分别为84.0%和88.2%。

图3 NaCl 胁迫对根冠比的影响Fig.3 Effect of NaCl stress on root shoot ratio

2.4 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期生物量的影响

本试验中，生物量最大的接骨木无性系为PT-2和PT-1（图4）。在4 个处理环境下，变化幅度最小的接骨木无性系是PT-2 和XY-2，分别为12.0%和23.1%。表明NaCl 盐胁迫对PT-2 和XY-2 的抑制程度较低。

图4 NaCl 胁迫对生物量的影响Fig.4 Effect of NaCl stress on biomass

2.5 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期细胞膜透性的影响

图5 NaCl 胁迫对细胞膜透性的影响Fig.5 Effect of NaCl stress on membrane permeability

2.6 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期叶绿素含量的影响

接骨木无性系XY-2 在T1环境下叶绿素含量急剧下降，降幅达到31.9%（图6）。此时光合作用极有可能受到抑制。在T3环境下，较对照T0，XY-3 的叶绿素含量最大，达到6.65 mg/g，下降幅度为44.3%，呈显著性差异。JY-1 的叶绿素含量最低，为4.07 mg/g，降幅为33.0%，表明在NaCl盐胁迫下无性系XY-3 的光合作用受抑制较小，无性系JY-1 光合作用受抑制较大。

图6 NaCl 胁迫对叶绿素含量的影响Fig.6 Effect of NaCl stress on chlorophyll content

2.7 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期SOD 活性的影响

随着NaCl 溶液胁迫的增加，7 个接骨木无性系SOD 活性均不同程度地出现先上升后下降的趋势（图7）。在轻度盐胁迫T2环境下，各接骨木无性系的SOD 活性达到最大值，表明在此NaCl盐浓度处理下7 个无性系超氧化物歧化酶（SOD）活性达到最大耐受值。较对照T0，增幅最大的无性系为XY-3 和JY-1；增幅最小的无性系为PT-1和XY-2，分别为16.0%和17.6%。当NaCl 溶液浓度达到T3环境浓度时，较对照T0，7 个无性系SOD 活性出现下降趋势。其中，SOD 活性最大且下降幅度最大的无性系为XY-2，下降幅度为21.6%；下降幅度最小的无性系为JY-1，下降幅度为1.0%。表明无性系XY-2 受高浓度NaCl 盐胁迫影响较大，无性系JY-1 受影响较小。

图7 NaCl 胁迫对SOD 活性的影响Fig.7 Effect of NaCl stress on SOD activity

2.8 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期可溶性糖含量的影响

随着NaCl 溶液浓度的增加，7 个接骨木无性系可溶性糖含量均出现不同程度的上升趋势（图8）。NaCl 盐胁迫下，植物可溶性糖会大量集聚，从而提高植物的耐盐能力。可溶性糖含量上升幅度最大的无性系为XY-3 和XY-1；可溶性糖含量上升幅度最小的无性系为PT-3 和JY-1，较对照T0，上升幅度达28.3%和60.1%。表明无性系XY-3 和XY-1 的可溶性糖含量受NaCl 盐胁迫影响较大，无性系PT-3 和JY-1 的可溶性糖含量受NaCl 盐胁迫影响较小。

图8 NaCl 胁迫对可溶性糖含量的影响Fig.8 Effect of NaCl stress on soluble sugar content

2.9 NaCl 胁迫对接骨木无性系苗期脯氨酸含量的影响

随着NaCl 溶液浓度的增加，7 个接骨木无性系脯氨酸含量均出现不同程度的上升趋势（图9）。本试验中，较对照T0，上升幅度最大的无性系为XY-3 和PT-2；上升幅度最小的无性系为JY-1 和PT-1，分别为54.5%和84.1%。表明无性系XY-3和PT-2 的辅氨酸含量受NaCl 盐胁迫影响较大，无性系JY-1 和PT-1 的辅氨酸含量受NaCl 盐胁迫影响较小。

图9 NaCl 胁迫对脯氨酸含量的影响Fig.9 Effect of NaCl stress on proline content

2.10 主成分分析

对7 个接骨木无性系所测的所有指标进行主成分分析，结论见表3。在T2环境胁迫下，第1主成分贡献率为46.629%，第2 主成分贡献率为26.265%，第3 主成分贡献率为14.588%，前三主成分累计贡献率达87.482%。根据各指标成分值的大小可知，在T2环境处理下，影响主成分较大的指标有株高增量、地径增量、细胞膜透性、可溶性糖含量等4 个指标。在T3环境处理下，第1主成分贡献率为38.657%，第2 主成分贡献率为27.568%，第三主成分贡献率为19.346%。前三主成分累计贡献率达85.570%。结合主成分分析进行综合评价，得到7 个接骨木无性系耐盐能力，由强到弱为XY-2、XY-3、XY-1、JY-1、PT-1、PT-3、PT-2（表4）。西洋接骨木的耐盐能力强于接骨木，金叶接骨木（加拿大接骨木变种）的耐盐能力介于西洋接骨木与接骨木之间。

表 3 无性系NaCl 胁迫主成分分析Table 3 Principal components of NaCl stress of clones

表4 7 个无性系的主成分值Table 4 First principal component value of seven clone

3 结论与讨论

3.1 讨 论

在不同浓度NaCl 盐分胁迫下，植物通过调节生长生理反应机制来使植物保持生命机能平衡。7个接骨木无性系在不同NaCl 盐浓度胁迫下，生长指标株高、地径的增长量随NaCl 浓度的增加呈下降趋势。说明NaCl 盐胁迫越大，越不利于接骨木生长发育[14]。根系是与NaCl 胁迫溶液接触最密切的器官，对NaCl 盐胁迫也是较为敏感的器官，当植物受到NaCl 盐分胁迫时，NaCl 盐分对根茎叶的伤害程度也是不同的，在高浓度NaCl 盐胁迫下，植物器官受影响程度依次是叶、茎、根。地上部位受影响程度比地下部位严重[16]。导致地上部位生物量增长小于地下部位。因此，NaCl 盐胁迫下根冠比增加[17]。本试验研究表明，在NaCl 盐胁迫下，由于接骨木不同器官对NaCl 盐分的适应性不同，其生物量的分配策略会有所改变，根冠比会发生改变。接骨木根冠比随NaCl 溶液浓度增加而增加。

当植物受到NaCl 盐分胁迫时体内的活性氧自由基会大量生成，导致细胞膜上的磷脂分子因氧化而受到严重破坏，从而引起细胞膜透性的变化甚至丧失，植物叶片的电解质外渗，相对电导率会因磷脂分子受到破坏程度的不同而不同[16]。本试验研究表明，接骨木7 个无性系细胞膜透性随NaCl 盐胁迫的增加而增加，这与党晓宏等[18]研究NaCl 胁迫对3 种滨藜属Atriplex植物幼苗叶片的细胞膜透性生理响应结果一致。

叶绿素是一类含脂的绿色色素，在植物进行光合作用中起着不可替代作用。叶绿素极易受到光、酸、碱、氧、氧化剂等外界条件的干扰而分解[19]。在NaCl 盐分胁迫下，植物体内产生大量的活性氧自由基，从而导致叶绿素分解。光合作用受到影响，植物的生长发育受到抑制[18]。本试验结果表明，随着NaCl 溶液浓度的增加，7 个接骨木无性系叶绿素含量均出现不同程度的降低趋势。超氧化物歧化酶（SOD）是一种抗氧化酶，能够消除生物体内氧化自由基等有害物质。在生物体内抗氧化机制中起着十分重要的作用。在NaCl 盐分胁迫下，为了尽快消除细胞内过量产生的氧自由基，抑制细胞膜上的磷脂分子的破坏，植物自身诱导体内SOD 活性加强适应胁迫环境[20]。当NaCl 盐分浓度过大时，SOD 的合成受到抑制，降解速率加快，导致活性下降，抗氧化效率降低[21-22]。本研究发现，随着NaCl 溶液浓度的增加，7 个接骨木无性系SOD 含量均出现先上升后下降的趋势，与贾漫丽等[23]研究盐胁迫对4 个桑树Morus alba品种的超氧化物歧化酶的影响变化趋势一致。

可溶性糖对细胞膜和原生质体的稳定性具有一定的保护作用，参与构建细胞内有机碳架和合成能量，当细胞内无机离子浓度过高时可溶性糖可以起到保护酶活性的作用，是参与渗透调节重要的物质之一[24]。而脯氨酸不仅是生物体内很好的渗透调节物质，也是细胞膜结构和生物酶活的保护物质，也是自由基的清除剂，在植物受到NaCl 盐分胁迫时起到保护作用，脯氨酸还可调节植物体内钾离子在液泡中的含量情况来对细胞质渗透平衡进行调节，以保证植物正常代谢生长[25]。本试验表明，当NaCl 溶液浓度升高时，7 个接骨木无性系的可溶性糖出现不同程度的提高，这与方志红等[26]研究NaCl 胁迫对碱蒿Artemisia anethifolia的茎叶中可溶性糖含量逐渐增加的结果一致。随着NaCl溶液浓度的不断升高，当7 个接骨木无性系受到NaCl 盐胁迫后，其细胞内的脯氨酸含量也出现不同程度的升高。这与孙聪聪等[27]研究NaCl 胁迫后期对银杏幼树脯氨酸代谢的影响结果一致，也与杨传宝等[14]对白杨派无性系苗期脯氨酸对NaHCO3胁迫的响应结果一致。

本次试验运用主成分分析将上述多个指标进行分析，得出7 个接骨木无性系耐盐顺序为XY-2＞XY-3＞XY-1＞JY-1＞PT-1＞PT-3＞PT-2。耐盐最佳的2 个接骨木无性系为XY-2、XY-3（均为西洋接骨木）；当然本研究也存在一定局限性，试验仅通过对以上7 个接骨木无性系的9 个生长生理指标进行测定评价，其结果只能说明7 个接骨木无性系在这9个指标上耐盐能力的大小；另外，本试验采用接骨木半年生扦插盆栽苗进行试验，而林木耐盐碱能力在不同发育阶段及不同环境下，其适应性会发生变化，因此，下一步将对接骨木无性系其它生长生理指标的变化，如根系活力、内源激素含量变化等进行研究，同时对大田中成年接骨木的耐盐能力进行综合评价，以进一步验证该结论。

3.2 结 论

本研究采用盆栽试验的方法，利用不同浓度的NaCl 溶液进行胁迫处理，分析不同处理下各无性系的各指标变化，并对其进行综合评价，确定其耐盐性，为盐碱地造林提供优良无性系。研究发现，随NaCl 盐分浓度的不断增大，7 个接骨木无性系的苗高、地径和生长量增量生长指标均表现出下降的趋势；各无性系根冠比和细胞膜透性指标出现升高趋势；而无性系的叶绿素含量不断下降；各无性系的超氧化物歧化酶活性均不同程度地出现先上升后下降的趋势；渗透调节物可溶性糖含量和脯氨酸含量均随NaCl 胁迫浓度增加而增加。综合评价得出接骨木无性系耐盐程度由强到弱依次为XY-2、XY-3、XY-1、JY-1、PT-1、PT-3、PT-2。其中，无性系XY-2、XY-3 具有较强耐盐性,可作为耐盐接骨木无性系材料进行下一步研究。