雌性侏儒症大鼠繁殖性能初探

焦淑凡，徐龙妹，华征宇，姚菊芳

（上海交通大学医学院附属仁济医院，上海 200127）

本课题组在Wistar 大鼠长期的繁育过程中偶然发现与同龄、同性别个体相比体型显著矮小的大鼠，经“全同胞兄妹交配”培育成近交品系，并将其命名为SDWR，即自发性侏儒症Wistar 大鼠（spontaneous dwarfism Wistar rat）[1]。至2020年9 月，SDWR 大鼠已稳定连续近交达34 代。在针对SDWR大鼠的长期研究过程中发现，与Wistar大鼠相比，侏儒症大鼠产仔数、窝重和离乳率均明显降低，并伴随一定比例的不育现象，说明SDWR 存在生育下降的问题。近年来，不孕不育患者呈逐渐上升的趋势，成为社会关注的焦点，其治疗也是生殖医学的重点和难点。卵巢功能衰退是临床常见导致生育能力下降的原因之一，其病因复杂，与遗传、感染、代谢、免疫、环境、手术、药物和心理等多种因素有关[2-3]。笔者推测SDWR繁殖率低下可能与卵巢功能有密切关联。本文通过探索SDWR 大鼠低繁殖率的原因，期望对人类生育力低及不孕不育的研究和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SDWR大鼠选自本课题组培育第30代的侏儒症大鼠（SDWR 组）。正常封闭群Wistar 大鼠（作为对照组）购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK（沪）2017-0005]。所有大鼠饲养于上海交通大学医学院附属仁济医院屏障设施+IVC[SYXK（沪）2016-0009]。

1.2 药物、试剂与仪器

孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）（宁波第二激素厂），批号S18080，1 000 U 冻干粉；人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）（丽珠集团丽珠制药厂），批号171113，2 000 U 冻干粉；M2 培养液和透明质酸酶（美国Sigma公司）；HE 染色试剂盒（北京索宝生物科技有限公司）。石蜡包埋机（EG1150）、石蜡切片机（RM2235）、体视显微镜（DMi8）和正置生物显微镜（DM2500）均购自德国Leica 公司。

1.3 检测方法

1.3.1 繁殖性能的比较

选择12 周龄SDWR 及Wistar 雌鼠、雄鼠各5 0 只进行繁殖实验。按1 ♀∶1 ♂长期同居，确定妊娠时将雌性孕鼠分笼饲养，统计SDWR 及Wistar 大鼠1～4 胎繁殖情况。通过妊娠率、产仔率、初生窝重、离乳重、离乳率比较分析二者繁殖性能。

1.3.2 性成熟期及动情期观察

选择SDWR及Wistar雌鼠各20只，其中SDWR大鼠8 周龄（繁育过程观察其性成熟在12 周左右），Wistar 大鼠5 周龄（性成熟在6～8 周左右），用于性成熟期及动情周期的观察。在每日8∶00、20∶00，分别做阴道脱落细胞涂片，根据涂片中的细胞形态，判断大鼠所处的性周期阶段，连续观察出现2 个完整的动情周期。正常雌性大鼠的动情周期为4～5 d，分为动情前期、动情期、动情后期、动情间期。当第一次出现完整的动情周期，并观察到外阴口变大且伴随红肿、湿润时，可判定为性成熟。阴道脱落细胞涂片方法：用生理盐水（0.9%NaCl 溶液）湿润的棉签置入阴道内1 cm，轻柔旋转1 圈，取出准备好生理盐水的载玻片，将棉签上脱落细胞均匀地涂抹于载玻片，75%乙醇溶液固定，HE 染色，盖玻片封固，光学显微镜下观察动情周期[4]。

1.3.3 超排卵效果观察

选择6～8周龄SDWR及Wistar雌鼠各20只。实验前分别用PBS 将PMSG 和hCG 稀释至200 U/mL，分别用200 U/kg、300 U/kg、400 U/kg剂量的PMSG+hCG 进行腹腔注射（超排卵组）。PMSG 注射48 h 后注射hCG，hCG 注射后24 h，用3.5%水合氯醛1 mL/100g 腹腔注射麻醉大鼠。酒精棉球消毒腹部，打开腹腔找到输卵管，用眼科剪将输卵管取出，置于含M2 培养液的培养皿中。于正置显微镜下找到输卵管膨大部位，用显微镊子将膨大部撕开，这时卵母细胞团会自动滑出。用口吸管将卵母细胞团移至透明质酸酶的培养皿中进行消化，在显微镜下观察卵母细胞团表面颗粒细胞消化情况。当卵母细胞与颗粒细胞发生分离时，即刻用口吸管将卵母细胞移至新鲜M2 培养液中轻柔冲洗6 遍。收集卵母细胞至新鲜M2 培养液中，显微镜下计数卵母细胞数量，比较SDWR 与Wistar 大鼠的促排卵效果。

1.3.4 卵巢组织形态观察

选择6～8 周龄雌鼠，对照组、SDWR 组及SDWR 超排卵组（300 U/kg，PMSG+hCG）各20只，将各组大鼠卵巢组织置于质量分数为4%的多聚甲醛溶液中固定24 h 后，进行脱水，透明，石蜡包埋，切片（5µm）。然后将切片放入60 ℃烘箱中烤3 h，脱蜡水化，流水冲洗1 min，苏木精染色10 min，流水冲洗1 min，伊红染色约1 min，乙醇溶液梯度脱水，中性树脂封固，光学显微镜下观察卵巢组织形态。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 繁殖性能比较

结果显示，1～4 胎SDWR 组妊娠率、产仔数量、初生窝重、离乳重及离乳率均显著低于对照组Wistar 大鼠，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

表 1 SDWR 与Wistar 大鼠繁殖情况比较Table 1 Comparison of reproductive performance between SDWR and Wistar rats

2.2 性成熟期及动情周期比较

阴道脱落细胞涂片观察动情周期结果显示，SDWR 和Wistar 大鼠均出现完整的动情周期，对照组Wistar 大鼠出现完整动情周期在（8.05±0.76）周龄，而SDWR 大鼠在（12.15±0.81）周龄，说明SDWR 大鼠性成熟时间与Wistar 大鼠相比明显推迟（P＜0.01）。

涂片观察可见，动情前期以膨大有核上皮细胞为主，可见少量白细胞及无核角化上皮细胞（图1A）；动情期以大量的无核角化上皮细胞为主，可聚集成堆（图1 B）；动情后期白细胞、无核角化上皮细胞和有核上皮细胞均可见（图1C）；动情间期细胞总数较少，以白细胞为主，可见少量角化上皮细胞及有核上皮细胞（图1D）。另外，实验发现对照组Wistar 大鼠一个规律的动情周期需要4～5 d；而SDWR 大鼠一个动情周期约7～8 d，且动情期缩短，动情间期延长，提示SDWR 组大鼠动情周期延长和紊乱。

图 1 阴道脱落细胞涂片染色结果（A～D）和各组卵巢组织学观察（H～E）Figure 1 The results of Gram staining of the rat vaginal smears (A-D) and morphological observation of the ovarian tissue in each group（H-E）

2.3 超排卵效果比较

超排卵结果显示，200 U/kg 、300 U/kg、400 U/kg 的PMSG+hCG 在SDWR 大鼠中均获得极低的超排效果。200 U/kg 、300 U/kg 和400 U/kg PMSG+hCG 注射后SDWR 大鼠平均排卵数量分别为（1.0 ±1.4）个、（1.2 ±1.6 2）个和（1.6 ±1.5）个，显著低于对照组Wistar 大鼠的（4 2.8 ± 5.0）个、（4 2.2 ± 4.5）个和（4 0.4 ±4.7）个。

2.4 卵巢组织形态学观察

对照组Wistar 大鼠可见生长活跃的各级卵泡，颗粒细胞层排列整齐，黄体数量多，发育良好（图1E）；SDWR 组大鼠卵巢中未见初级卵泡、次级卵泡，窦状卵泡黄体数量较对照组Wistar 大鼠明显减少，卵巢皮质发生纤维化，并且颗粒细胞排列紊乱，提示其可能存在颗粒细胞功能受损，从而导致卵子发育障碍（图1 F、1G）。采用300 U/kg 的PMSG+hCG 注射SDWR大鼠后，SDWR 超排卵组大鼠卵巢内的各级生长卵泡没有明显增加（图1H），黄体数量较对照组Wistar 大鼠仍减少，提示SDWR 大鼠对PMSG+hCG 可能不敏感。

3 讨论

本课题在长期研究过程中发现，SDWR 大鼠繁殖力低下，为探索其原因展开了本研究。通过分析SDWR 和Wistar 大鼠繁殖性能发现，Wistar大鼠1～4胎平均窝产仔数12～14只，离乳重45～50 g，与文献报道一致[5]；而SDWR 大鼠第1～4 胎的妊娠率、窝产仔数量、初生窝重、离乳重及离乳率均显著低于Wistar 大鼠，说明雌性SDWR 大鼠繁殖性能比Wistar 大鼠低下。动情周期检测结果显示，S D W R 大鼠性成熟周龄比Wistar 大鼠明显推迟，出现动情周期延长及紊乱。大鼠的动情周期可以间接反映卵巢功能[6]。因此，本研究结果提示SDWR 大鼠卵巢功能可能发生改变。

排卵数量是影响生育力的重要因素。有研究表明，约27%的不孕症由排卵障碍引起[7]。通过200 U/kg、300 U/kg、400 U/kg PMSG +hCG 超排卵实验发现，3 种剂量促排卵效果无明显差异，结果显示6～8周龄对照组Wistar大鼠获得良好超排卵效果，而SDWR大鼠极难获取数目较多的卵母细胞，差异有统计学意义（P ＜0.01）。为了进一步验证，作者也曾选取不同厂家的PMSG（舒生，批号180716，1000 IU）和hCG（艾力生，批号B190303）进行实验，得到同样的超排结果。临床超排卵不敏感的现象称为卵巢低反应（poor ovarian response，POR）[8]。SDWR 大鼠繁殖性能测定结果说明，SDWR 大鼠可以自然进行繁育，未取得良好超排效果可能与激素剂量、用药时间、SDWR 大鼠的动情周期等多因素有关，有待后续进一步探讨。

目前，人类卵巢早衰发病率呈上升趋势，病因不明，该病可能是导致生育功能减退及不孕不育的重要原因[9-10]。为了解SDWR 大鼠卵巢功能对繁殖率的影响，本研究对SDWR 大鼠卵巢组织进行病理切片染色，观察卵巢组织结构及各级卵泡发育状态，结果显示，SDWR 大鼠窦状及各级卵泡极少见，卵巢颗粒细胞排列紊乱，出现卵巢皮质纤维化，呈现卵巢早衰表现，提示SDWR 大鼠卵巢功能损伤及卵巢低反应可能是导致繁殖率低下的原因之一。常见卵巢早衰模型有放化疗药物造模法、免疫损伤造模法、半乳糖代谢造模法、基因敲除造模法等[11-12]，不同的造模方法根据其独特性适用于不同的实验研究，具有一定局限性。本研究发现SDWR 大鼠自身存在卵巢功能低下现象，因此有可能通过SDWR 大鼠建立一个适用于多种病因研究的天然卵巢早衰模型。

不孕不育已逐渐成为我国已婚人群的重要疾病之一，约7%～15%的育龄夫妻受其困扰[13]。据世界卫生组织预测，不孕不育可能会成为人类继肿瘤、心脑血管疾病之后的第三大顽疾。辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART），是治疗不孕不育的主要手段。尽管ART在治疗不孕不育取得显著进展，但是POR 始终是其面临的难点和挑战[14-15]。ART 在体外受精的超控制性促排卵过程中大约有9%～24%的患者发生POR[16]，尤其在≥40 岁的高龄女性中发生率超过50%[17]，而POR 具体发病机制尚不明确。目前临床上常用激素替代疗法治疗卵巢早衰，但可能会引起乳腺癌、心脏病和中风等严重不良反应[18]。因此，本实验可能具有临床研究意义，培育的侏儒症大鼠有望作为研究卵巢早衰及卵巢低反应的天然模型，为改善卵巢功能及提高生育力研究和治疗提供理论依据。

最近研究揭示，微RNA 与卵巢基因表达[19]、颗粒细胞的发育、卵泡刺激素的分泌有关[20]。miR-27b、miR-190、miR-151、miR-672、miR-29a和miR-144 表达[21]、BNC1 基因缺失[22]、COMT基因rs4680位点A等位基因及CpG-8和CpG-10甲基化水平升高都与POF 的发生发展密切相关[23]。微RNA 表达、基因缺失和甲基化是否在SDWR大鼠卵巢功能减退中起到重要调节作用，有待进一步研究。

致谢：本课题实施和完成阶段得到了上海市计划生育研究所黄先亮医生、上海交通大学医学院附属仁济医院生殖中心厉心愉医生的支持，谨致谢意。