辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞比值失衡在HBV相关肝脏疾病进展中的作用

唐光俊, 游 晶, 刘怀鄂, 彭玉娟

昆明医科大学第一附属医院 感染性疾病和肝病科， 昆明 650032

HBV感染至今仍呈世界性流行，慢性乙型肝炎(CHB)是当今最严重的世界性传染病之一，极大影响公众健康及加重卫生系统负担。感染HBV后，若患者自身免疫力不足以清除病毒，可发展为CHB。HBV持续大量复制，肝脏长期处于慢性炎症状态，在免疫系统作用下可进一步发展为肝硬化、肝细胞癌(HCC)等严重疾病。 辅助性T淋巴细胞17(Th17)与调节性T淋巴细胞(Treg)失衡所引起的免疫系统调节失衡在CHB病情进展中扮演着重要角色，了解该失衡机制及过程对于疾病认识、治疗及延缓病情进展具有重要意义。

1 Th17与Treg

Th17是Harrington等[1]于2005年在小鼠体内发现的一种由CD4+T淋巴细胞分化出的新型辅助性Th亚群，视黄酸受体相关的孤儿受体γt(orphan nuclear receptor, RORγt)为标志性转录因子[2-3]。在TGFβ的存在下及IL-6、IL-23协同下，通过JAK/STAT、NF-ΚB/MAPK等多条信号途径由CD4+T淋巴细胞分化而成[4-5]。

Treg是Sakaguchi等[6]于1995年发现的一种由CD4+T淋巴细胞分化出的新型辅助性Th亚群，叉状头转录因子3(forkhead box p3, Foxp3)为标志性转录因子[7]。根据Treg的来源及稳定性的不同，可以将其分为两类，第一类为天然调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Treg)，存在于胸腺中并形成一个相对稳定的趋势，由于独特的微环境获得抑制能力，在免疫稳态中发挥关键作用；第二类为诱导调节性T淋巴细胞(induced regulatory T cell, iTreg)，在外来抗原刺激下，经TGFβ诱导非Treg转化，稳定性较差[8-10]。

CD4+T淋巴细胞分化为Th17与Treg的过程中[11]，IL-6在两条分化路径中均起作用，这使得两种细胞分化存在一定的竞争关系并处于动态平衡中。而且IL-6还可以决定分化途径的方向，当IL-6不存在时分化向Treg子集；在IL-6存在的情况下则分化向Th17子集。此外由Th17分泌的IL-21与TGFβ一起可激活STAT3途径增加了RORγt的表达，加大CD4+T淋巴细胞分化为Th17的力度，并抑制Foxp3的表达，从源头上减少Treg的分化产生[12]。

Th17在机体中表现为免疫监视，可加强免疫反应、促进炎症发展；是一种高度促炎的细胞，以分泌IL-17为其最主要特征[13]，IL-17包括IL-17A、IL-17F等亚群，可增强针对细胞外细菌、真菌和病毒的适应性细胞免疫应答；还可分泌IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及TNF等细胞因子，具有募集、活化中性粒细胞等作用。Th17还具有效应器功能，可诱导免疫应答、激活炎性细胞、促进肝细胞炎症进展、炎症的慢性转归[14]。随着CHB患者肝脏炎症的加重及进展，Th17及其分泌的细胞因子也大量增加，因此Th17及其分泌的细胞因子可能是CHB中促进肝脏炎症进展及损害肝细胞的影响因素之一。在体循环中，IL-17维持炎症前环境，通过释放粒细胞巨噬细胞集落因子(granulocyte macrophage colony factor, GM-CSF)刺激粒细胞生成；促进内皮细胞的激活，在外周血中释放趋化因子5等吸引性趋化因子，大量表达中性粒细胞，导致炎症的发生，发挥免疫学效应及产生免疫应答[15]。

Treg在机体中主要体现为负向调节，表现为免疫抑制、抗炎、维持免疫系统稳定，防止机体自身抗体对抗原的免疫应答，避免自身免疫性疾病出现及在感染诱导的免疫反应期间过度的诱导T淋巴细胞活化和随后出现的组织损伤。正常情况下CD4+T淋巴细胞经由TGFβ诱导分化一定数量Treg维持免疫系统稳定；当机体受到致病菌感染时，TGFβ与IL-6一起诱导CD4+T淋巴细胞分化产生大量Th17，导致炎症发生及进展。Treg在自身免疫性疾病、肿瘤发生与进展、器官移植等方面广泛参与；雷帕霉素(rapamycin, RAPA)作为一种新的免疫抑制剂，在观察不同剂量RAPA治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠模型研究[16]中发现,高剂量RAPA通过诱导实验小鼠体内Treg扩增来影响Th17/Treg平衡，可更好地缓解EAE小鼠的炎症。而且大鼠肝移植相关实验[17]中，通过使用半乳糖凝聚素(galactosin, gal)下调NF-κB/RelB蛋白表达来干扰未成熟树突状细胞(immature dendritic cells, imDC)的成熟，促使Treg大量分化并诱导外周免疫耐受，用于治疗移植排斥。作用方式分为两类，第一类为分泌IL-4、IL-10及TGFβ等抑制性细胞因子，通过细胞因子作用于相关受体细胞进行抑制作用，如通过分泌IL-10抑制T淋巴细胞增殖及产生细胞因子；第二类为直接与相应细胞表面受体直接结合进行抑制作用，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)与B7配体结合后产生抑制信号，抑制T淋巴细胞的活化[18]从而抑制免疫反应。 Th17/Treg失衡可导致机体免疫系统破坏，进而引起相应的免疫性疾病，如T淋巴细胞中黑素缺乏症会异常调节Th17与Treg平衡失调，导致自发性结肠炎的发生[19]。

2 Th17/Treg失衡与CHB

Th17可促进CHB患者的免疫活化，其分化频率增加促进肝脏炎症进展[20]。Treg分化频率也呈同等趋势，但分化程度较Th17弱，故Th17/Treg分化失衡，使得IL-6、TGFα等炎症诱导因子高水平表达，大量分泌导致中性粒细胞等炎性细胞浸润，加重肝细胞及肝组织炎症进展并引起免疫系统反应。Th17分化数量及所占比例升高与CHB患者血清中ALT水平升高呈正相关，但与血清中HBV DNA载量无相关性，故Th17可能促进肝脏炎症进展并使病程延长，而不是清除CHB患者体内的HBV[21]。Treg分化增加可以有效阻止肝细胞及组织炎症进展，为减轻肝脏损伤发挥积极作用，避免组织破坏的病理性免疫应答发生；但免疫抑制导致免疫逃逸也为病原体长期存在提供生存空间，延长慢性感染的病程，长此以往使疾病病程延长，并增加疾病加重及恶化风险[22]。

Th17与巨噬细胞关系密切，广义来说巨噬细胞可分为两大类，一是经典激活的巨噬细胞(M1型)，被IFNγ、脂多糖(LPS)等介导，具有促进炎症反应、灭杀微生物和释放多种炎症因子等作用，表现为自身抗原呈递能力上升；二是替代激活的巨噬细胞(M2型)，可分泌TGFβ和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)下调炎症反应并促进组织修复。HBcAg可以选择性损害M2表型，并通过Toll样受体2(TLR2)途径激活M2巨噬细胞促进炎性细胞因子的产生，进一步加重肝脏炎症反应[23]。

3 Th17/Treg失衡与肝纤维化、肝硬化

CHB患者未抗病毒治疗或治疗效果不佳，体内HBV持续大量复制，使肝脏长期处于慢性炎症；炎症是慢性肝病的标志性病理特征，持续存在的炎症可致使肝组织纤维化进而发展为肝硬化。肝纤维化的特征为细胞外基质(ECM)的大量异常形成和累积，从而导致肝脏结构的重塑。肝星状细胞(HSC)是诱导肝组织纤维化发生、进展的关键细胞，HSC本身能够产生细胞因子和趋化因子，可能是启动肝纤维化发生的关键因素。Sun等[24]通过小鼠四氯化碳肝组织纤维化动物模型发现，Th17/Treg失衡与小鼠肝组织纤维化存在一定相关性，在体外Th17可促进HSC的活化，但被Treg抑制；两者可以相互转化，因此纠正两者平衡，抑制Th17和增加Treg可能为治疗肝纤维化的方法之一。

Th17/Treg失衡程度与肝脏炎症程度和纤维化程度呈正相关[25]。CHB患者体内Th17大量分化，分泌IL-17诱导HSC活化和促进肝纤维化，具体包括HSC的激活，炎症细胞的募集，促炎和促纤维化细胞因子的表达，刺激胶原合成，导致基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和组织金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)之间的失衡[26]。机体正常情况下细胞分泌TIMP拮抗MMP破坏降解酶作用，若拮抗作用减弱或者消失，会导致ECM大量累积。IL-17发挥作用表现为，一方面诱导NF-κB和STAT3快速转移到细胞核[27]，从而激活IL-6和TNFα等促炎细胞因子和TGFβ等促纤维化因子的基因转录；另一方面直接促进HSC增殖、TGFβ受体的上调[9]，使其表达增加。TGFβ是特征明确的促肝纤维化因子，通过两种途径共同作用于HSC，使之被激活，产生大量ECM，例如胶原蛋白、蛋白质和糖蛋白的合成，并下调MMP表达和促进TIMP表达来抑制ECM降解，导致ECM异常积蓄[28]，从而促进ECM抑制胶原酶的分解[29]，导致肝纤维化的发生及进展，进而发展至肝硬化。而不可溶弹性蛋白质含量升高，提示肝硬化晚期难以逆转[30]。CHB相关肝硬化患者中Th17/Treg比值与临床分期密切相关，可能作为区分代偿性肝硬化和非代偿性肝硬化的有效指标，不但参与发病而且与病情进展及预后有关[31]。

目前越来越多的研究表明肝硬化的发病机制涉及许多信号通路，如TGFβ/Smad (SMAD) 信号通路，大量激活的TGFβ可以激活SMAD信号通路，促使静止的HSC转化为成纤维细胞，进而发展为纤维化最终导致肝硬化[32]。微小核糖核酸(micribonuclease, miRNA)作为基因调控成员并被认为是治疗肝脏疾病的一种前景方法，引起了广泛关注[33-34]。miR-454可以通过抑制Wnt10a的表达来抑制HSC的活化和增殖，从而抑制肝纤维化及肝硬化[35]。

4 Th17/Treg细胞失衡与HCC

尽管相关分子生物学和肿瘤治疗手段取得重大进展，HCC术后生存率有所提高，但早期远处广泛转移，早期诊断手段缺乏和不灵敏，局部多次复发，仍让HCC患者总体生存率仍处于较低水平。当HBV患者进展至肝纤维化甚至肝硬化时，发展至HCC风险极高。

Treg/Th17失衡可致HCC患者免疫力降低，免疫耐受力下降，导致肿瘤细胞的免疫逃逸。Th17通过分泌炎性细胞因子来加强免疫反应，Treg分泌免疫抑制性细胞因子来抑制免疫反应[36]。Treg抑制免疫反应表现为两方面，一方面通过抑制肿瘤内的细胞引流局部淋巴结内的效应细胞，另一方面是阻止效应T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞。相关研究[37]表明，Treg的水平与HCC大小密切相关，肿瘤较大患者外周血中Treg的水平显著高于肿瘤较小患者，随着HCC的发展，Treg比例增加，提示对HCC的侵袭和转移具有促进作用，因此外周血中Treg的数量可能是HCC诊断和预后的潜在标志。以上提示HCC微环境中Treg比例的减少或许会促进肿瘤免疫治疗的效果。Th17在HCC发病机制中也存在两面性，一方面可分泌IL-6激活癌基因STAT3，上调诱导肿瘤血管生成的基因，促进肿瘤的生长和转移；另一方面可分泌IL-17和IFNγ，增加细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)的表达，抑制肿瘤的生长[38]。而且在肝癌病灶旁组织中可以发现IL-17细胞因子高表达，与肝脏微小血管密度及增生呈正相关，增加癌组织血管侵犯、脏器转移等风险[39]；Th17及其分泌的相关细胞因子还随TNM分期加重而升高，提示可能对HCC的局部免疫产生负面调节作用，总之Th17/Treg失衡加重HCC病情；且相关研究[40]表明，高Th17水平是肿瘤复发的危险因素。在胆道恶性肿瘤中发现，Treg在肿瘤中心积累，表面癌细胞可能已经能够逃脱宿主免疫系统，而且癌细胞产生的细胞因子，如IL-6和TGF-1在肿瘤微循环中诱导Treg异质性，造成肿瘤的恶化，因此为了延缓肿瘤进展，可能有必要控制Treg[41]。

肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)是存在于不同类型肿瘤中的细胞亚群，当移植到动物宿主中时具有自我更新、分化和致瘤能力。CSC与肿瘤微环境中的细胞相互作用，并受其调控，进而激活癌细胞中的多种途径及各种炎症细胞因子，包括Th17细胞因子网络。因此调节Th17以抑制CSC存活，是治疗肿瘤的一种合理猜想，其作用途径可通过消除与不良预后相关的Th17细胞因子引起的有害炎症和刺激Th17细胞因子对肿瘤的抗肿瘤反应两个方面改善治疗预后。在发现Th17前，阻断IL-23、IL-1β或IL-6的治疗方法在临床上已证明有效，如阻断IL-1β功能的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)用于治疗类风湿关节炎。IL-21的抗肿瘤作用也在许多肿瘤免疫疗法的临床模型中观察到，具有刺激细胞毒性并诱导NK细胞产生IFNγ和穿孔素的作用[42]，可使肿瘤消退甚至阻碍肿瘤生长[43]。

5 Th17/Treg细胞失衡与肝衰竭

HBV相关慢性肝衰竭是在肝硬化或HCC基础上出现的一类重型肝炎，为CHB发展至肝硬化或HCC时并发症中较为严重的一种。临床上目前主要以对症支持治疗、改善患者症状为主。原位肝移植是目前治疗慢性肝衰竭较为有效的方法。但肝脏的配型成功率及术后免疫反应是制约成功率的最大障碍。

在肝衰竭过程中，Th17使大量M1型巨噬细胞激活并聚集导致炎症进一步发展，进而使慢性肝衰竭加重[44]。据Zhang等[45]研究发现，Th17/Treg比值与病情严重程度相关，而且高比值也提示CHB相关的慢性肝衰竭患者预后不良；Th17升高程度与疾病严重程度为正相关，同时Th17水平较高也是患者死亡的独立预测因子。相关实验[46]表明，TGFβ导致小鼠急性肝功能衰竭，除了抑制肝细胞增殖外，还可以诱导细胞死亡，从而导致总体肝细胞损伤增加，加重肝衰竭进程，TGFβ诱导Th17大量分化，分泌大量炎症因子，导致炎症风暴。

间充质干细胞表现出可塑性黏连，多谱系分化能力及多功能性基因的表达。可抑制巨噬细胞浸润，下调巨噬细胞，介导促炎性M1巨噬细胞向消炎M2型巨噬细胞转化，促进M2巨噬细胞表型和Treg的分化，从而使M1/M2型巨噬细胞比例和Th17/Treg平衡向抗炎状态倾斜，抑制炎症进展；同时将CD4+T淋巴细胞系统转化为抗炎状态，显著改善损伤，促进肝细胞增殖和抑制肝细胞凋亡[47]，改善慢性肝衰竭患者肝脏损伤情况，可为改善慢性肝衰竭患者症状提供潜在性治疗作用[48]。

6 展望

目前CHB治疗方案主要为服用核苷酸类似物，可在HBV复制时作为共价闭合环状DNA(covalently closed circledna, cccDNA)复制的替代模板，使病毒复制失效，但是不能对cccDNA产生作用，无法彻底清除HBV，患者需长期服药甚至终生服药。因此单纯依靠核苷酸类似物难以彻底治愈CHB，为达到临床治愈需加用免疫调节制剂，如IFN等，提高患者机体自身免疫力，并且使机体免疫系统重建。

Th17和Treg源于辅助T淋巴细胞，是人体免疫系统重要构成部分。二者失衡在HBV相关肝脏疾病中持续存在，且在每个阶段中扮演角色各不相同。详细了解由CHB进展至HCC、肝衰竭中每个阶段Th17和Treg失衡具体情况，依据失衡情况了解病情变化，找到新的治疗方案及治疗介入最佳时机具有重要意义。故深入研究HBV相关肝脏疾病病程中以辅助T淋巴细胞为首的免疫细胞变化过程及结果，可为疾病的治疗提供新方案，并为开发新型药物及选择不同药物治疗提供可能性。

作者贡献声明：唐光俊负责文献阅读，撰写论文；刘怀鄂、彭玉娟负责提供意见并修改；游晶负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。