驴乳对小鼠肠道菌群的影响

文/祝可昕 张 奇＊ 张 明 武丽辉

（1 北京城市学院生物医药学部；2 新疆玉昆仑天然食品工程有限公司；3 农业农村部农药检定所）

驴乳作为一种天然的食品资源，近年来已逐渐成为研究开发的热点[1]。与其他奶源相比，驴乳是一种低脂肪、低胆固醇、高钙、富硒、美容、抗衰老的天然乳品。《本草纲目》中对驴乳的描述为“气味甘，冷利，无毒，热频饮之可治气郁，解小儿热毒，不生痘疹”[2]。

驴乳是接近人乳的天然乳[3]，具有抗氧化、增强人体免疫力等功能[4，5]，其营养价值远优于牛乳与羊乳。在对驴乳的前期研究中发现，驴乳中必需氨基酸和一些特殊生理活性氨基酸的含量均高于牛乳[6]，且经发酵后活性氨基酸可显著提升[7]。据报道，驴乳在抗炎等领域具备其特殊功效[8]。尽管维吾尔族经典土方表明，驴乳具备调理肠道功能，但尚缺乏系统科学研究数据支持。

本研究以抗生素致小鼠肠道菌群失调模型为实验动物，以驴乳为微生态调节剂，低聚果糖为阳性对照物，平板计数法测定肠道中肠杆菌、乳酸菌的含量和比例变化，并通过16S rDNA扩增子测序技术，测定驴乳干预后模型动物肠道菌群丰度与变化，探索驴乳调理肠道功能的可能性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

无特定病原体（SPF）级昆明（KM）小鼠20 只，雄性，体重18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2016-0011]；盐酸林可霉素（货号：L8390）、头孢唑啉钠（货号：C9680）、氨苄西林钠（货号：A8180），购于北京索莱宝科技有限公司；驴乳冻干粉由新疆玉昆仑天然食品工程有限公司提供；MC、VRBA培养基购于北京陆桥技术股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 肠道菌群失调动物模型的建立[9]

随机选取15 只KM小鼠，无菌条件下采集其粪便，随后灌服抗生素溶液（以无菌生理盐水配制的盐酸林可霉素、头孢唑啉钠及氨苄西林钠的混合液，3 种抗生素的终浓度均为20 mg/mL），0.2 mL/只，每天2 次，连续3 天。收集灌胃小鼠粪便，采用平板计数法对乳酸菌和肠杆菌进行检测，以乳酸菌菌落数显著降低且降低程度高于肠杆菌为模型建立成功标准。

1.3 分组及干预

将抗生素处理的15 只小鼠随机分为模型对照自然恢复组（A组，生理盐水）、驴乳复原乳干预组（B组，固形物含量为9.6%驴乳复原乳）、低聚果糖阳性对照组（C组，100 mg/mL低聚果糖生理盐水溶液）3 组，每组5 只，另选未经抗生素处理的5 只小鼠作为空白对照（D组），A、B、C组每天灌胃2次，0.2 mL/只/次，连续6 天。

1.4 粪便采集及微生物计数

于灌胃前（第0天）、灌胃3天后（第3天）和灌胃6 天后（第6天）在无菌条件下采集小鼠粪便，稀释后分别涂布MC培养基和VRBA培养基平板，37 ℃培养48 h后，对乳酸菌和肠杆菌进行计数分析。

1.5 微生物区系分析

为了进一步证明驴乳对小鼠肠道紊乱模型肠道微生态的改善作用，在无菌条件下收集模型自然恢复组、空白对照组、低聚果糖阳性对照组以及驴乳干预组6 天后的试验小鼠粪便，每组随机选择2 只小鼠粪便作为测序样品，委托北京博云华康基因科技有限公司对粪便中的16S扩增子进行测序，并进行微生物菌群多样性分析。

1.6 统计方法

以Excel对各组小鼠肠道菌群进行分析，计算（x±s），比较各组之间差异。

2 结果与讨论

2.1 动物模型构建

无菌条件下收集15 只抗生素灌胃小鼠粪便，以平板计数法检测灌胃前后粪便中的乳酸菌和肠杆菌的变化。与空白对照组相比，经抗生素灌胃后，小鼠肠道中乳酸菌与肠杆菌含量均显著降低（p＜0.01），且抗生素灌胃小鼠粪便中乳酸菌含量降低更多，降低比例显著高于肠杆菌，根据模型判断标准，判断模型建立成功（表1第0天）。

2.2 驴乳对乳酸菌和肠杆菌的影响

分别对第0天、第3天和第6天各组小鼠肠道菌群进行检测。结果表明，经驴乳复原乳和低聚果糖干预后，小鼠肠道菌群中的乳酸菌与肠杆菌含量均显著提升，6 天后，乳酸菌基本恢复至正常水平，而模型自然恢复组乳酸菌和肠杆菌的恢复均显著低于低聚果糖阳性对照组和驴乳干预组（表1、图1）。

表1 肠道紊乱模型构建及干预后肠道菌检测[（x±s），lg CFU/g，n=5]

图1 驴乳对小鼠肠道菌群影响

对8 只小鼠粪便进行16S扩增子测序，并分析其肠道微生物种类和丰度，结果如图2所示。经驴乳复原乳和低聚果糖干预后，小鼠肠道菌群丰度显著提升，与空白组相当，模型自然恢复组肠道菌群的丰度较低，说明驴乳具备显著的改善肠道微生态功能。

进一步对微生物类型进行分析发现，经驴乳复原乳干预的小鼠，肠道菌群中的双歧杆菌（Bifidobacterium sp.）、乳杆菌（Lactobacillus sp.）、阿克曼菌（Akkermansia sp.）等有益菌含量均高于模型自然恢复组；与抗过敏相关的多尔氏菌属（Dorea sp.）丰度也显著恢复；与改善动脉粥样硬化相关的罗斯拜瑞氏菌（Roseburia sp.）也有效恢复[10]。同时，拟杆菌属（Bacteroides sp.）、埃希氏菌属（Escherichia sp.）等[11]条件致病菌含量降低。

图2 肠道菌群区系分析

3 讨论

本研究根据文献报道进行致肠道紊乱的抗生素类型的选择[9]，同时调整抗生素终浓度至20 mg/mL，灌胃KM小鼠，建立肠道菌群紊乱小鼠模型。经检测，灌胃小鼠粪便中肠杆菌与乳酸菌均由1×108CFU/g降至约1×104CFU/g，且乳酸菌下降更多，含量低于肠杆菌，适合于肠道微生态干预恢复研究。

由模型构建可知，抗生素对肠道菌群影响巨大，尤其对益生菌破坏严重，直接影响肠道功能与机体健康。通过本研究，发现驴乳具有显著的促进肠道菌群恢复功能，经驴乳复原乳干预后的小鼠肠道菌群丰度显著提升，与正常空白对照组相当，且对机体有益的菌种含量恢复明显，比例提升，即服用驴乳对改善因服用抗生素导致的肠道功能紊乱具有促进作用。

此外，本研究通过16S扩增子测序分析，发现了一些与健康有关的微生物如Roseburia sp.含量的提升。据报道，肠道中拥有Roseburia sp.的小鼠，与没有该菌的普通小鼠相比，患动脉粥样硬化的几率明显下降，且炎症发生更少[10]。

4 小结

本研究采用抗生素灌胃构建小鼠肠道紊乱模型，随后以驴乳复原乳干预，采用平板计数法和16S扩增子测序法探索小鼠肠道菌群变化。结果发现，经驴乳复原乳干预后的模型小鼠肠道菌群丰度显著提升，与模型自然恢复组相比，乳酸菌恢复更快，益生菌比例提高，条件致病菌含量较低。由此可见，驴乳可有效改善小鼠肠道菌群，促进肠道健康。