米诺环素对碱烧伤大鼠角膜新生血管生成的影响及其作用机制△

石琛 肖启国 王智 刘翀 张亚兰 刘明之

角膜新生血管是角膜常见的病理改变，也是常见的致盲原因，探明角膜新生血管的发生机制，寻找有效的防治药物具有重要的临床意义。米诺环素是一种半合成抗生素，除了具有广谱的抗菌作用外，还具有抗炎[1-2]、抗血管生成、抑制基质金属蛋白酶的产生和活性等[3-4]作用。本研究通过建立碱烧伤大鼠角膜新生血管模型，探讨米诺环素对碱烧伤后角膜新生血管生成的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物选取6～8周龄SPF级健康SD大鼠72只(取右眼为实验眼)，体质量200～250 g(南华大学动物实验中心提供)。实验前常规裂隙灯检查，排除眼表相关疾病。

1.1.2 主要仪器与试剂裂隙灯显微镜及摄像系统[卡尔蔡司(中国)有限公司]，米诺环素盐酸盐(中国生工生物工程股份有限公司)，CD206、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体(武汉贝茵莱生物科技有限公司)，Trizol核酸蛋白提取试剂(上海昂博生物技术有限公司)，YBR Green PCR试剂盒[安诺伦(北京)生物科技有限公司]，逆转录试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]，二抗Max Vision TM (鼠/兔)试剂、PBS缓冲液以及各种引物(武汉华联科生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及分组造模前3 d，予大鼠双眼滴妥布霉素滴眼液清洁结膜囊。从72只大鼠中随机选取24只(24眼)作为空白对照组(不做任何干预)，其余48只大鼠按照4 mL·kg-1标准给予100 g·L-1水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，并给予盐酸奥布卡因滴眼液滴眼3次，将用1 mol·L-1NaOH浸润过的实验滤纸置于大鼠右眼角膜中央40 s，之后用生理盐水冲洗结膜囊60 s，建立角膜碱烧伤模型，然后随机分为溶剂对照组和米诺环素组，每组24只(24眼)。溶剂对照组在大鼠角膜碱烧伤后给予9 g·L-1NaCl溶液(10 mL·kg-1)腹腔注射，米诺环素组在大鼠角膜碱烧伤后给予米诺环素溶液(45 mg·kg-1)腹腔注射。

1.2.2 大鼠角膜相关检查项目分别于碱烧伤后1 d、4 d、7 d、14 d用裂隙灯观察大鼠角膜上皮缺损及角膜新生血管情况并拍照。参照文献[5]方法，将角膜由水平、垂直两轴划分为4个部分，采用Image-Pro Plus 6.0软件测量4个部分弯曲度小且向角膜中央延伸最长血管的长度，分别计算各部分角膜新生血管面积并求和。然后在每个时间点每组随机抽取6只大鼠，处死并摘取角膜组织，分别用于HE染色、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测。

1.2.2.1 HE染色和免疫组织化学染色将各组大鼠角膜组织固定、包埋、切片，采用HE染色结合Image J图像分析系统进行炎症细胞计数；采用二步法进行免疫组织化学染色检测TNF-α、CD206蛋白表达，用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对所拍摄照片中阳性反应部位进行分析，测累积光密度值(IOD值)，每个标本重复检查3次取平均值。

1.2.2.2 实时荧光定量PCR检测采用实时荧光定量PCR检测各组大鼠角膜组织中一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)mRNA的相对表达量。取大鼠角膜组织置于Trizol中，提取总RNA，消除总RNA中的DNA及DNase1，采用实时荧光定量PCR试剂盒进行反转录，扩增iNOS、Arg-1 mRNA，将β-actin作为内参照。引物序列如下：iNOS正向引物为 5’-GGCTGAAGTGGTATGC-3’，反向为5’-CCAGTGTGTGGGTCTC-3’；Arg-1正向引物为5’-TCCCCAATGACAGCCC-3’， 反向为5’-CCACCCAAATGACGCA-3’；β-actin正向引物为5’-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3’，反向为5’-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3’。用相对定量方法2-△△Ct进行计算，以空白对照组作为参照，计算米诺环素组、溶剂对照组目的基因mRNA的相对表达量。

1.3 统计学分析对实验所得数据采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析。对溶剂对照组Arg-1 mRNA相对表达量与角膜新生血管长度和面积进行Pearson相关分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 眼表形态及角膜新生血管生成情况整个实验过程中，空白对照组大鼠角膜透明，无角膜新生血管。碱烧伤后1 d，溶剂对照组、米诺环素组均观察到大鼠结膜混合性充血，未见明显角膜新生血管长出。碱烧伤后4 d、7 d、14 d，米诺环素组及溶剂对照组均可见角膜新生血管长出，但米诺环素组角膜新生血管长度及面积均小于溶剂对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.01)(见图1和表1)。

图1 溶剂对照组、米诺环素组大鼠角膜碱烧伤后裂隙灯下眼表改变

表1 溶剂对照组、米诺环素组大鼠角膜碱烧伤后不同时间角膜新生血管长度及面积比较

2.2 角膜炎症细胞计数情况HE染色发现，空白对照组角膜结构清晰，上皮细胞排列整齐，无血管结构。碱烧伤后1 d，米诺环素组及溶剂对照组均可见不同程度角膜上皮缺损、组织结构紊乱，两组大鼠角膜炎症细胞数无明显差异。碱烧伤后4 d、7 d、14 d，溶剂对照组与米诺环素组每个视野(×200)炎症细胞数分别为(119.83±7.28)个、(81.83±8.30)个，(92.50±7.34)个、(42.33±9.11)个，(48.33±7.76)个、(16.67±4.93)个，各时间点两组间比较差异均有统计学意义(均为P<0.01)，米诺环素组炎症细胞数均少于溶剂对照组。

2.3 角膜组织中iNOS、Arg-1 mRNA表达变化实时荧光定量PCR检测，结果显示，与空白对照组相比，碱烧伤后1 d、4 d、7 d、14 d溶剂对照组iNOS、Arg-1 mRNA相对表达量均升高(均为P<0.05)；与溶剂对照组相比，碱烧伤后4 d、7 d米诺环素组iNOS mRNA相对表达量均明显减少(均为P<0.05)，而在碱烧伤后1 d、14 d，两组间差异均无统计学意义(均为P>0.05)；与溶剂对照组相比，米诺环素组Arg-1 mRNA相对表达量在碱烧伤后14 d显著减少(P<0.01)，而在碱烧伤后1 d、4 d、7 d，两组差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见图2)。

2.4 碱烧伤后M2型巨噬细胞和M1型巨噬细胞在角膜组织占比优势分析将空白对照组Arg-1和iNOS mRNA相对表达量比值设为1，如实验组比值>1表明M2型巨噬细胞占优势，比值<1则表明M1型巨噬细胞占优势。结果显示，溶剂对照组碱烧伤后4 d、7 d、14 d，Arg-1和iNOS mRNA相对表达量比值分别为0.73±0.14、0.82±0.90、1.71±0.21(均为P<0.01)。

2.5 Arg-1 mRNA相对表达量与角膜新生血管长度、面积相关性分析结果双变量相关性分析结果显示，溶剂对照组中Arg-1 mRNA相对表达量与角膜新生血管长度和面积均呈显著正相关，相关系数分别为0.898(P=0.000)、0.781(P=0.000)。

2.6 角膜组织中TNF-α、CD206蛋白表达情况免疫组织化学染色检测结果显示，空白对照组实验全程角膜组织中均未见TNF-α、CD206蛋白表达；碱烧伤后1 d、4 d，溶剂对照组与米诺环素组相比，TNF-α、CD206蛋白表达的IOD值差异均无统计学意义(均为P>0.05)；碱烧伤后7 d、14 d，溶剂对照组TNF-α、CD206蛋白表达的IOD值均高于米诺环素组(均为P<0.05)(见图3)。

图3 碱烧伤后不同时间溶剂对照组与米诺环素组角膜组织中TNF-α、CD206蛋白表达的IOD值 *P<0.05。

3 讨论

寻找有效防治角膜新生血管的药物并探明其作用机制，是目前眼科学者关注的热点。本研究中，我们通过观察碱烧伤后角膜形态学变化发现，使用米诺环素干预4 d后，大鼠角膜新生血管长度及面积较溶剂对照组均明显减少，炎症细胞浸润下调，说明米诺环素能有效减轻碱烧伤后角膜炎症反应，抑制碱烧伤后角膜新生血管的生成。

既往研究提示，巨噬细胞与脉络膜、视网膜新生血管生成均密切相关，但巨噬细胞在角膜新生血管形成中所产生的作用一直存在争议。Sakurai等[6]研究表明，氯磷酸脂质体诱导的巨噬细胞凋亡抑制了角膜新生血管的生成，而其他的研究[7]则与此相反，这一矛盾产生的原因可能是由巨噬细胞的不同表型引起的。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞之一，具有高度可塑性，它可在各种趋化因子和细胞因子驱动下极化为促进炎症反应的M1型和促进血管生成的M2型，这在调控炎症反应、血管生成、组织损伤修复中起重要作用[8-9]。为了证实巨噬细胞极化是否调控角膜新生血管的生成，本研究对碱烧伤后角膜中M1型及M2型巨噬细胞相关标志物进行了检测。以往研究表明[10]，巨噬细胞向M1型极化时，iNOS、TNF-α呈高表达；而向M2型极化时，大量分泌Arg-1、CD206等因子，因此检测iNOS、TNF-α、Arg-1、CD206等的表达水平可反映巨噬细胞向不同表型的极化情况。本研究通过检测上述细胞因子的表达发现，在碱烧伤早中期，M1型巨噬细胞占明显优势，而在碱烧伤后期，M2型巨噬细胞逐渐占优。而角膜形态学检查及HE染色结果显示，随着碱烧伤后时间延长，角膜组织中炎症细胞逐渐减少，角膜新生血管逐渐增加，且与M2型巨噬细胞细胞标志物呈正相关。由于M1型巨噬细胞可以分泌大量的炎症因子，而M2型巨噬细胞则可以促进新生血管的发生发展，说明巨噬细胞极化调控了碱烧伤后角膜炎症的发生及角膜新生血管的生成。

修彬华等[11]建立了蛛网膜下腔出血大鼠模型，通过检测巨噬细胞活化标志物Iba-1的表达，发现米诺环素可以抑制巨噬细胞活化，进而减轻促炎因子、活性氧等物质诱发的一系列病理损伤，改善血管病变。为了明确米诺环素抑制角膜碱烧伤后新生血管化与巨噬细胞极化的关系，我们将溶剂对照组与米诺环素组的数据进行了对比，结果显示，米诺环素在碱烧伤后早期显著减轻了角膜碱烧伤后炎症反应，并且降低了M1型巨噬细胞相关标记物(iNOS及TNF-α)的表达水平，而在碱烧伤后晚期，米诺环素则抑制了M2型巨噬细胞相关标记物(Arg-1及CD206)的表达。这些结果表明，米诺环素抑制角膜碱烧伤诱导的角膜新生血管生成过程，这可能与巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化被抑制，而向M2型巨噬细胞极化增强有关，即极化的巨噬细胞可能恢复成非极化表型，当活化的巨噬细胞被抑制而重新转变到沉默状态时，角膜新生血管的生成将受到抑制。

综上所述，我们的研究初步表明巨噬细胞极化调控角膜碱烧伤后新生血管的生成，米诺环素可能通过调控巨噬细胞的极化，抑制碱烧伤后角膜新生血管的生成，这为阐明角膜新生血管的发生及米诺环素的作用机制提供了新认识。