LAMC1在神经胶质瘤中的表达水平与临床特征及预后的关系*

唐连刚，张乃崇，赖廷海

茂名市人民医院神经外一科(广东茂名 525000)

胶质瘤是最常见的脑肿瘤，约占原发性恶性脑肿瘤的80%，据世界卫生组织(WHO)的分类，胶质瘤可分为低级别胶质瘤(Ⅰ/Ⅱ级)和高级别胶质瘤(Ⅲ /Ⅳ级)[1]。Ⅰ/Ⅱ级星形细胞瘤是缓慢生长的肿瘤，没有侵袭性特征，而Ⅲ /Ⅳ级胶质瘤表现出与高增殖活性，强侵袭能力和新生血管形成相关的恶性表型。虽然在过去的几十年中胶质瘤治疗取得了不少的进展，但其临床效果仍不太理想[2]。研究[3]表明，胶质母细胞瘤(GBM，Ⅳ级)的中位生存时间在诊断后持续不到15个月。虽然近年来对胶质瘤中癌基因和肿瘤抑制因子进行了不少的研究，单胶质瘤的发生和发展的分子机制仍未完全明确。基底膜是细胞黏附的细胞外基质，其将神经元、神经胶质、上皮细胞、内皮细胞和来自相邻结缔组织的其他细胞分开。基底膜为细胞提供物理屏障，有助于细胞黏附、增殖、迁移和存活[4]。基底膜的主要结构组分包括层粘连蛋白(laminin)、Ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖perlecan和集聚蛋白，层粘连蛋白是异源三聚体家族，各自由α、αβ和αγ亚基组成[5]。目前已经鉴定了5个α，4个β和3个γ亚基链。这些亚基的不同组合组装了16种不同的哺乳动物层粘连蛋白同种型。层粘连蛋白γ1(Laminin subunit gamma-1，LAMC1)由LAMC1基因合成，其在早期和晚期细胞形态发生中起重要作用[6]。LAMC1的C-末端层粘连蛋白型球状结构域是位于α-亚基C-末端的主要受体结合结构域，其与整联蛋白、α-肌萎缩蛋白、肝素的硫酸化相互作用，通过N-末端LN结构域的相互作用进行聚合[7]。LAMC1在层粘连蛋白亚基中广泛表达，主要在基底膜中发现，脑膜瘤中上调的LAMC1表达与肿瘤复发呈正相关[8]。研究[9]表明，上调的LAMC1可能促进肿瘤转移，因此LAMC1可能是治疗人类癌症的重要治疗靶点。但目前LAMC1在神经胶质瘤中的表达水平与临床特征，以及其对患者预后的影响仍未明确。本研究旨在探讨LAMC1在神经胶质瘤中表达及与临床特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年6月至2018年2月因神经胶质瘤于我院行手术治疗患者共68例的病理组织石蜡块资料，纳入标准：(1)术后病理确诊为神经胶质瘤；(2)患者临床资料和随访资料完整；(3)术前未进行放疗、化疗和靶向治疗；排除合并免疫性疾病，以及合并其他肿瘤或其他肿瘤脑转移的患者；另外10例正常脑组织标本来自患有创伤性脑损伤且经内部减压手术治疗的患者。本研究获得医院伦理委员会审核并批准。68例神经胶质瘤患者中男41例，女27例，确诊时平均年龄(42.3±5.7)岁，范围26～64岁，根据WHO 中枢神经系统肿瘤分类标准，其中Ⅰ级9例，Ⅱ级18例，Ⅲ级21例，Ⅳ级20例。

1.2 临床标本收集和免疫组化 免疫组化染色检测均由我院病理科医师进行，所有的神经胶质瘤或正常脑组织常规固定在10%中性缓冲甲醛溶液，并进行常规石蜡包埋。将石蜡包埋的神经胶质瘤或正常脑组织切成5 μm进行制片。在二甲苯中脱蜡并再水合后，用3%H2O2孵育将切片用过氧化物酶封闭，在1 mmol/L乙二胺四乙酸中进行微波加热抗原修复。使用5%胎牛血清(FBS)来阻断非特异性结合位点。然后，将切片与第一抗体孵育，大鼠抗LAMC1单克隆抗体(anti-LAMC1，ab80580，Abcam，Cambridge，UK)在4℃孵育过夜。在第一抗体反应后，将样品与HRP标记的山羊抗鼠二抗室温孵育30 min。并使用过氧化物酶底物进行可视化，未与一抗孵育的切片用作阴性对照。由本院2名病理科医师每个切片随机选择5个视野(×200)拍照后进行后续分析。

1.3 免疫组化评估 通过Image-Proplus 6.0软件通过每张测量组织照片中神经胶质瘤组织和正常脑组织的LAMC1表达水平。先采用软件对照片进行校正光密度，再根据免疫组化染色选择特定染色物的颜色，采用平均光密度评估LAMC1的表达水平，具体先测量一下有效测量区域的面积，再测量这个面积范围内目标染色区域的累积光密度值IOD，两者相除得到mean density。通过68例神经胶质瘤组织的LAMC1的表达水平取通过取中位数作为cut-off值区分为LAMC1高表达和LAMC1低表达。

1.4 临床资料收集和随访 通过患者病例资料查找纳入研究患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤周围水肿情况、患者术后复发情况、IDH1基因突变情况，记录所有神经胶质瘤患者的临床WHO分期。所有患者通过电话和网络随访记录患者的生存时间和复发情况。

2 结果

2.1 LAMC1在神经胶质瘤组织中的表达情况 LAMC1在正常脑组织和神经胶质瘤组织的表达情况如图1所示，其中神经胶质瘤组织的平均LAMC1表达水平为0.672±0.094，正常脑组织的平均LAMC1表达水平为0.132±0.041，神经胶质瘤组织的LAMC1表达水平显著高于正常脑组织，差异有统计学意义(P<0.001)。

注：A：正常脑组织中LAMC1的表达；B：WHO分级为Ⅰ级的神经胶质瘤组织LAMC1表达；C：WHO分级为Ⅱ级的神经胶质瘤组织LAMC1表达；D：WHO分级为Ⅲ级的神经胶质瘤组织LAMC1表达；E：WHO分级为Ⅳ级的神经胶质瘤组织LAMC1表达

2.2 LAMC1在神经胶质瘤组织表达与临床特征的关系 其中神经胶质瘤组织中LAMC1表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤周围水肿和IDH1突变没有显著的相关性(P>0.05)，而LAMC1在WHO分期为Ⅲ～Ⅳ期高表达的比例显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，且术后复发的患者其LAMC1高表达的比例显著高于术后未复发的患者(P<0.05)，见表1。

表1 LAMC1在神经胶质瘤组织表达与临床特征的关系(n=68) 例

2.3 LAMC1在神经胶质瘤组织表达与预后的关系 68例神经胶质瘤患者的随访时间为5～36个月，中位随访时间为19个月，其中神经胶质瘤组织中LAMC1高表达的患者其总体生存率显著低于LAMC1低表达的患者，差异有统计学意义(HR=2.035，95%CI：1.113～3.723，P=0.021)，见图2。

图2 神经胶质瘤组织的LAMC1表达水平对患者总体生存率的影响

2.4 LAMC1表达与神经胶质瘤临床预后的多元Cox回归分析 综合68例患者的临床特征进行Cox 多因素分析，结果显示LAMC1高表达(HR=1.952，95%CI：1.106～2.354，P=0.017)、肿瘤大小≥35 mm、WHO分期为Ⅲ～Ⅳ期、术后复发和合并IDH1突变是影响神经胶质瘤临床预后的风险因素(P<0.05)，见表2。

表2 乳腺癌患者COX多因素生存分析 (n=68)

3 讨论

胶质瘤是成人中最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，并且其肿瘤存在高度异质性和预后不良。尽管结合手术切除、放疗和化疗的疗法取得了一定的进展，胶质瘤仍是最致命的人类癌症之一，不到5%的患者存活超过5年[10]。目前胶质瘤其具体的分子机制仍未明确，找到胶质瘤的有效治疗靶点仍是目前研究的重点。LAMC1是一种对基底膜组装必不可少的蛋白质，既往报道层粘连蛋白在肿瘤组织中对组织发育、肿瘤细胞侵袭和转移具有重要作用[11]。层粘连蛋白存在于细胞外基质和细胞膜中，作为检测的潜在生物标志物。目前LAMC1在胶质瘤中的表达水平及对临床预后的影响仍未明确。本研究中首次通过组织学检测了LAMC1在胶质瘤组织中的表达和临床意义。本研究结果初步表明，在胶质瘤组织中LAMC1的蛋白质表达水平显著增高，且LAMC1表达水平与WHO分期、术后复发和预后密切相关，表明了LAMC1是影响胶质瘤患者预后的风险因素。

LAMC1编码层粘连蛋白γ1链，其是层粘连蛋白最常见的γ亚基，并参与各种恶性肿瘤的病情进展。本研究中，LAMC1其在胶质瘤中表达水平显著升高，且与WHO分期密切相关，表明了LAMC1的表达水平随着肿瘤的恶性程度增加而增高。最近研究[12]证实LAMC1在宫颈癌中上调，其表达与FIGO分期、子宫肌层浸润、颈/附件受累、血管淋巴管浸润和淋巴结转移显着相关。对247例肝细胞癌患者的转录组数据集进行无偏随机存活森林分析，发现LAMC1表达上调与晚期肿瘤分期呈正相关，LAMC1高表达的患者总体无肿瘤存活率较低[13]。通过微阵列分析研究多发性骨髓瘤，不同类型发现细胞外基质含量在不同的RPMI-8226抗药性亚系中有所改变，LAMC1基因在泼尼松耐药亚系中大量过表达[14]。且LAMC1与子宫癌的不同亚型及其临床分期有关，与正常增殖和分泌性子宫内膜相比，其中LAMC1几乎检测不到，在从非典型增生到低级别和高级别子宫内膜样癌的上皮细胞中观察到LAMC1表达增加[15]。

本研究也明确了LAMC1高表达的胶质瘤患者其临床预后不良，且LAMC1是影响胶质瘤患者其临床预后的风险因素。尽管LAMC1在肿瘤中具有明确的生物学意义，但其异常表达的调节机制及其功能背后的机制仍有待研究。既往研究[16]miRNA在调控LAMC1的表达中具有重要的作用，在前列腺癌中，LAMC1是miR-29s的直接靶标。而在人肝细胞癌中，SP1反式激活LAMC1启动子，LAMC1的表达受到Wnt信号通路的调节[17]。此外，PI3K/AKT、NF-κB和JAK/STAT3信号通路可能与COL1A1介导的侵袭密切相关[18]。这些研究为LAMC1在胶质瘤细胞中的调控机制提供了新的研究方向。

综合上述，本研究结果初步表明了LAMC1在神经胶质瘤中表达水平显著增高，且与胶质瘤的WHO分期及临床预后密切相关。对于LAMC1在神经胶质瘤中的具体调控机制仍需要进一步深入研究。