遮荫对白及形态及叶片结构的影响

袁秀云 许申平 周一冉 王喜蒙 崔 波*

（1. 郑州师范学院生物工程研究中心，郑州 450044；2. 郑州大学生命科学学院，郑州 450001）

光照是植物生长发育必需的环境因子，不仅为植物进行光合作用提供能量，还对植物的生长发育、形态建成和生理代谢等产生重要影响［1～3］。在长期的生存适应进程中，植物演化出阴生、阳生和耐阴三大需光类型［4］。一般来说，阳生植物植株矮小，叶片和角质层较厚，栅栏组织发达，一定范围内的强光可提高其光合速率，而阴生植物则相反，植物叶片较薄、海绵组织疏松、通气结构发达，强光不利于其光合作用。在不同光照条件下，阴生植物三七（Panax notoginseng）幼苗的形态指标、不同器官干质量及分配，以及叶片性状均有明显变化［5］。遮荫能够促进阴生植物金莲花的生长发育，其株高、叶片数、叶面积等指标增大，叶绿体内基粒数和基粒片层显著增加，淀粉粒数量减少［6］。阳生植物骆驼刺（Alhagi sparsifolia）在林下的叶面积与自然光下相比显著降低［7］。对阳生植物玉米（Zea mays）来说，遮荫使其叶片变薄，叶绿体数目减少，基粒数、基粒厚度和片层数增加［8］。堇叶紫金牛（Ardisia violacea）即不是典型的阴生植物，也不是典型的阳生植物，有较强的耐阴性，在25%遮荫条件下，其比叶重显著增大，而60%和90%遮荫下比叶重显著减小［9］。这些研究表明，不同需光类型植物的形态结构对遮荫具有不同的响应。目前，多种植物如三七［5］、新娘草（Gibasis pellucida）［10］、玉米［8］、连香树（Cercidiphyllum japonicum）［11］、香果树（Emmenopterys henryi）［12］等在不同光照条件下的形态结构及生理代谢均有研究，而不同光照强度对白及生长发育及叶片结构影响的研究还未见报道。

白及（Bletilla striata）为单子叶兰科（Orchidaceae）植物，为我国传统中药，由于白及自然繁殖率低，长期以来的过度采挖使得野生白及植物资源逐年减少，人工栽培白及已势在必行［13］，但其栽培生理特性及生长发育方面的研究还较少。吴明开等的研究表明白及为阴生植物，人工种植时适当遮荫有利于其生长［14］。本课题组研究发现不同光照强度对白及叶片光合速率、叶绿素荧光参数及抗氧化酶活性等均有不同程度的影响，50%～70%的遮荫有利于白及的生长发育，能提高白及叶片的光合速率、表观量子效率及过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等的活性［15］。然而，白及光合作用对遮荫响应的叶片形态结构基础还不太清楚。为此本论文针对与光合作用相关的植物形态与叶片结构，以露地大田栽植的白及为试验材料，设置3个遮荫处理，对白及的外部形态及叶片显微结构进行观察分析，以从形态结构方面进一步解释白及光合生理响应的结构基础，为建立白及的人工栽培技术体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为二年生白及，栽培于郑州师范学院生物工程研究中心实践基地，土壤类型为潮土，株间距25 cm×25 cm。2018 年春季采用不同密度遮光网对样地进行遮荫处理，遮荫棚长8 m，宽3 m，遮光网高度1.5 m，每边遮光网距离地面40 cm，便于通风透气。设置3 个遮荫梯度：50%遮荫率、70%遮荫率、90%遮荫率，以全光照下的白及作为对照（CK）。每处理3 个重复，定期除草，适当浇水。

1.2 试验方法

1.2.1 形态结构的测定

遮荫处理3 个月后，在各处理样地内随机取样，使用卷尺、直尺（精度0.1 cm）测定白及的株高、叶数，测量自上而下第二片功能叶的叶长、叶宽，叶面积按椭圆公式计算，各处理测6株，另取各处理植株第二功能叶中部叶片组织用于显微结构的观察。

1.2.2 叶片气孔特征参数的测定

采用印迹法［16］将无色指甲油涂抹在白及叶片下表皮中间部位，20 min 后用镊子取完全风干的指甲油薄片，制成下表皮临时装片。使用光学显微镜（Leica DM2500，Germany）观察气孔特征，运用Leica application suite 显微测量软件对气孔密度、气孔器的长度（a）和宽度（b）进行测量，气孔面积（S）计算每个处理随机取30 个视野的平均值［11～12］。

式中：a为长；b为宽；π=3.14。

1.2.3 叶片解剖结构参数的测定

选取白及叶片中间部位，避开中脉，剪成面积约1 cm×1 cm 的矩形小块，经FAA 固定液固定后，参考Chen 等人的石蜡—冷冻混合切片法［17］，并稍作改进，采用FAA 固定液，经固定、脱水、浸蜡、包埋等一系列操作后，制成石蜡包埋块。使用冷冻切片机（Leica CM1950，Germany）切成厚度为6 μm的薄片，对蜡片进行摊片、烤片、脱蜡、1%番红溶液染色后，在光学显微镜下观察叶横切面特征，使用Leica application suite 显微测量软件测量叶片厚度、上下表皮厚度、叶肉厚度、上下表皮角质层厚度、相邻维管束距离等参数。

1.2.4 叶片超微结构的观察

取叶片主脉两侧组织约1 cm2，4%戊二醛溶液固定，磷酸缓冲液冲洗，依次进行脱水、包埋、切片、染色，VEGA3 TESCAN 型扫描电镜、JEM-1200EX型透射电镜下观察叶片超微结构。

1.2.5 数据分析

采用SPSS 20.0对数据进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 遮荫对白及形态结构的影响

露地大田栽培条件下，冬季白及地上部分全部凋落，春季重新萌发并快速生长，绿叶期集中在4～9 月，10 月下旬地上部分逐渐枯萎。不同遮荫条件下白及生长发育状况差异较大：CK 处理下白及植株矮小，叶片颜色偏黄，叶脉粗实突出，在光强较高的7 月，叶尖出现棕褐色点状斑块；50%和70%遮荫条件下植株生长旺盛，株型高大紧实，叶脉清晰明显；90%遮荫条件下植株叶型宽大，叶片颜色深绿，但长势较弱，叶脉触感不明显（见图1）。

从表1 可以看出，遮荫处理和CK 条件下白及叶片数量没有显著差异；而遮荫处理下的白及株高、叶长、叶宽、叶面积都高于CK，其中以50%遮荫处理下与对照的差异最大，株高、叶长和叶面积分别比CK 显著增加了47.56%、40.35%和84.20%。叶宽在90%遮荫条件下最大，比CK 条件下显著提高了33.45%。结果表明，遮荫处理能够促进白及地上部分茎叶的生长发育。

表1 不同遮荫处理对白及形态结构的影响Table 1 Effect of different shading treatments on B.striata morphological structure

2.2 遮荫对白及叶片气孔特征的影响

白及叶片的气孔主要分布在下表皮。通过白及叶片下表皮正面观显微观察显示（见图2），白及保卫细胞呈肾形，不同遮荫条件下，表皮细胞形态和大小差异较大。CK 条件下，白及表皮细胞多为不规则多边形，较小；随着遮荫强度的增加，白及叶片表皮细胞逐渐增大，50%遮荫条件下，表皮细胞呈不规则长方形。随着遮荫程度增加光照强度的降低，白及叶片气孔密度呈逐渐减小趋势。CK条件下，白及叶片气孔密度为113.50±2.55个/mm2，50%和70%遮荫条件下显著降低，气孔密度为CK条件下的87.22%、85.49%，而90%遮荫条件下气孔密度更小，只为CK 条件下的51.11%。气孔器长、气孔器宽和气孔面积均是CK 条件下的最大，70%遮荫条件下的最小，CK、50%遮荫和90%遮荫条件下，三者没有显著差异（见表2）。另外电镜下观察发现，CK 条件下，白及叶片表面粗糙，有许多颗粒状物质（见图2），这些颗粒可能是表皮分泌的角质层蜡质［18～19］，随着遮荫强度的增加，蜡质颗粒逐渐减少。

表2 不同遮荫处理对白及叶片气孔参数的影响Table 2 Effect of different shading treatments on B.striata leaves stomatal parameters

2.3 遮荫对白及叶片解剖结构的影响

白及叶片横切面结构显示（图3），其叶片由上表皮、下表皮、叶肉组织和叶脉组成。上下表皮均由一层细胞构成，上表皮没有气孔器，细胞较大，呈椭圆形；下表皮细胞相对较小，呈方形至圆形；叶肉细胞呈圆形至椭圆形，没有栅栏组织和海绵组织分化。

不同遮荫条件下白及叶片解剖结构有明显差异（见表3）。主要表现有：50%遮荫条件下，白及叶片厚度和叶肉厚度明显增大，叶片厚度分别比70%、CK、90%处理显著增加了13.92% 、15.76%、22.46%，叶肉厚度比70%、CK、90%处理增加了20.36%、20.65%和27.13%，下表皮厚度在三个遮荫条件下均显著增加，而维管束的距离在50%和70%遮荫条件下显著减小，在50%遮荫处理下最小，明显低于CK 和90%遮荫处理，90%遮荫处理下白及叶片相邻维管束距离最大；各处理条件下白及叶片上表皮厚度没有明显差异；上表皮和下表皮角质层厚度也没有明显差异（数据略）。

表3 不同遮荫处理对白及叶片解剖结构的影响Table 3 Effect of different shading treatments on B.striata leaf anatomical structure

2.4 遮荫对白及叶绿体超微结构的影响

CK 条件下，白及叶片叶绿体多数呈椭圆形或近球形，分布在细胞周围，基粒均匀分布在叶绿体中，相对于遮荫处理，基粒类囊体垛叠层数较少，基粒类囊体片层间隙小，叶绿体中有少量嗜锇颗粒和淀粉粒；在50%遮荫处理下，叶绿体多呈短梭形，叶绿体内均匀分布有大量基粒，基粒类囊体垛叠程度较高，类囊体片层较多，类囊体片层空隙较小，与基质类囊体分界清晰，边界整齐，见少量嗜锇颗粒和多数淀粉粒；70%遮荫处理下，叶绿体多数呈长梭形，有的基粒类囊体边界模糊，基质类囊体片层清晰可见，叶绿体内有多数嗜锇颗粒和少量淀粉粒；90%遮荫处理下，多数叶绿体近呈狭长梭形，基粒类囊体垛叠程度低，基粒类囊体片层数较少，排列疏松，基质类囊体片层更加明显，片层间具有较大空隙，叶绿体内可见嗜锇颗粒，偶见淀粉粒存在（见图4）。由此可见，全光照和90%遮荫下叶绿体超微结构发育不健全，适当遮荫有利于叶绿体基粒类囊体片层的发育和垛叠，其中50%遮荫条件下白及叶片叶绿体发育最为完善。

3 讨论

阳生植物和阴生植物对光强的适应能力不同，其生长发育和叶片结构对不同光照的反应也有差异。对车前（Plantago asiatica）轻度遮荫会显著增加其叶片宽度和叶柄长度；重度遮荫下车前叶长、叶宽、单叶面积及总叶面积显著增加，但重度遮荫下叶片数、株高等指标显著降低［20］。本研究中，遮荫对白及叶数没有明显影响，对白及株高、叶长、叶宽、叶面积有显著影响。3个遮荫条件下，白及株高明显高于CK，叶长、叶宽、叶面积显著高于CK，表明在遮荫条件下，白及通过增加植株高度从而向高空生长，通过增加叶片面积以获取更多的光资源；遮荫处理改变了白及营养器官的生长，增加了白及的纵向生长和横向生长，有利于白及光合器官的生长发育，这与药用植物三七的研究结果一致［5］。

植物叶片的形态、解剖结构和光合特性等方面会随着光环境的变化而呈现出适应性改变［21］。新娘草在25%、50%、75%和95%遮荫下，叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度均随光强的降低而显著降低［10］，显然，这是遮荫下的叶片增加光能捕获及利用效率的适应策略。多毛金花茶（Camellia hirsuta）在20%和30%光照条件下，叶片厚度增加，并具有更发达的栅栏组织和海绵组织，同时其叶片净光合速率和蒸腾速率也明显提高［22］，说明20%和30%光照下叶片结构更有利于其对环境的适应且光合能力更强。本研究中，全光照下白及叶片的气孔密度、气孔器长、气孔器宽、气孔面积明显高于3 个遮荫处理，而叶面积明显低于遮荫处理；50%和70%遮荫条件下，叶片厚度增加，维管束距离减小，分析认为，全光照下白及植株周围的环境温度较高，较大的气孔密度有利于蒸腾作用而快速散热；遮荫条件下，叶片面积的增加提高了光合面积，而维管束间的距离缩短有利于提高白及叶片水分运输速率和碳水化合物的运送能力，这些因素均有利于白及的光合速率。我们前期的研究也发现，在50%和70%遮荫下，白及叶片的净光合速率明显提高，同时具有较高的表观量子效率、最大净光合速率、光饱和点以及较低水平的光补偿点［15］，说明白及叶片遮荫下的形态结构与生理功能相适应。同时我们还观察到全光照条件下的表皮细胞向体外分泌较多的蜡质颗粒。据报道，植物表皮角质层蜡质具有避免植物体内水分过度散失、抵御紫外辐射、防止病虫害入侵等［23～24］，推测全光照下白及叶片表皮上较多的蜡质可能减少光照的伤害或避免水分的过度散失，这一推测还需要进一步试验验证。

尽管植物能够通过形态结构的改变适应一定程度的弱光和强光，但极度的弱光和强光对植物叶片的叶绿体结构却极为不利。全光照、遮光25%和95%条件对新娘草叶肉细胞的超微结构产生了轻微或巨大破坏，造成部分基粒类囊体片层和基质类囊体片层的扩张及部分叶绿体解体［10］。熊静等研究发现，与100%和6%光照条件相比，15%～52%光照条件下，朱砂根（Ardisia crenata）叶片拥有更多的叶绿体数量和完整的细胞结构［25］，表明过高或过低的光照条件均会对细胞结构造成损伤。增强光照可以增加玉米叶片叶绿体基粒和基粒片层的数目，同时基粒片层排列更加紧密；而遮荫则破坏了叶绿体结构，使叶绿体数量、基粒和基粒片层数量减少［26］。对花生的研究表明，耐阴性强的花生品种在中度弱光下，其叶绿体数量不变，叶绿体基粒数、基粒片层数显著增多，叶绿体发育完好，而严重弱光下，其叶绿体数、基粒数和淀粉粒数显著减少，叶绿体基粒片层出现破损［27］。本研究中，随着遮光强度的增加，白及叶片叶绿体由椭圆形或近球形变为短梭形、梭形、长梭形，说明叶绿体表面积逐渐增大，是叶绿体对光强变弱的积极适应；CK 条件下，叶绿体基粒类囊体片层数量少，我们前期研究显示PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）最低［15］，说明全光照对白及造成了光抑制，光合速率较低；50%遮荫处理增加了白及叶片叶绿体的基粒数和基粒类囊体片层数，类囊体片层垛叠紧密［15］，这种结构变化可以增加附着在基粒类囊体上的捕光色素，有利于光能在类囊体的传递，进而提高光合效率［28］。而70%和90%遮荫处理下白及叶绿体基质片层逐渐显现，基粒边界模糊，特别是90%遮荫处理下，白及叶片叶绿体基粒片层类似解体，垛叠程度降低，说明重度遮荫不利于叶绿体的发育及形态建成，进而对叶片的光合作用产生不利影响。

总之，不同遮荫条件对白及的叶片形态及叶绿体结构产生了不同程度的影响，从显微结构分析，不同光照通过改变白及叶片表皮气孔密度、角质层蜡质颗粒多少、叶肉厚度、维管束数量、叶绿体形状、叶绿体基粒类囊体和基质类囊体发育等影响白及叶片的光合作用；全光照下叶绿体基粒及类囊体片层数量少意味着露地大田不是白及最适的光照环境，50%遮荫增加叶肉细胞的厚度，有利于叶绿体类囊体的发育，产生较多的基粒及类囊体片层，增强其垛叠程度，而极度弱光降低了基粒类囊体片层的垛叠程度，不利于叶绿体的形态建成和发育。