miR-411-3p靶向MLK4对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响

曾爱兵，刘 华，冯 霞，许 红，李小华

(1.洪湖市人民医院泌尿外科，湖北洪湖 434000；2.湖北理工学院附属医院泌尿外科，湖北黄石 435002)

膀胱癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，全世界约300多万人受其影响[1]。2017年，膀胱癌是全球第5位最常见的癌症，男女发病率比约为4∶1。虽然膀胱癌的5年生存率是77%，但按照膀胱癌的类型和分期，其生存率明显下降。如果肿瘤细胞迁移到周围组织，5年生存率下降至35%；扩散到远处器官，则降至10%以下[2]。因此，较早发现无近端或远端转移的膀胱癌对于提高患者的生存率至关重要。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是一类长度约为20～25个核苷酸的非编码RNA[3]。miRNA在所有的生物学过程中都具有重要的作用[4]。miRNA可以在转录后RNA水平调控基因表达，且异常的miRNA表达与包括癌症在内的许多疾病相关[5]。有报道显示，miR-106在子宫内膜癌中过表达可促进RL95-2细胞增殖，抑制细胞凋亡[6]。还有报道称，下调表达的miR-124-3p可通过靶向MGAT5促进乳腺癌的增殖和转移[7]。也有报道表明，miR-506通过抑制孤核受体NR4A1的表达来抑制结直肠癌的发展[8]。miR-411-3p是位于14号染色体上的miRNA[9]，目前对其在肿瘤中作用少有报道。最近，WANG等[10]的研究揭示，长链非编码RNA CDKN2B-AS1通过HIF-1a/VEGF/P38通路与miR-411-3p相互作用，在体内外调控卵巢癌。HALVORSEN等[11]发现，miR-411-3p是与nivolumab治疗的非小细胞肺癌患者生存相关的7种miRNA之一。然而，miR-411-3p在膀胱癌细胞中的表达水平和生物学功能鲜有报道。本研究重点探讨miR-411-3p对膀胱癌细胞的影响及其潜在的作用靶点，为寻找新的治疗膀胱癌的药物靶点提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源选取洪湖市人民医院2018年10月至2019年10月期间手术切除的20例膀胱癌组织和癌旁组织作为样本。所有临床组织标本均由医院病理科免疫组化结果确认为癌组织或正常上皮组织。本研究通过洪湖市人民医院医学伦理审查会审核，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器5637细胞和人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)购于武汉Procell公司；miR-411-3p、MLK4过表达质粒载体购于中国RiboBio公司；pmirGLO载体、双荧光素报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司；10%胎牛血清、DMEM培养基购于美国Gibco公司；羊抗兔IgG-HRP、电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)试剂盒、RNase A、碘化丙啶、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；GAPDH、Ki67、PCNA、Bax、p53、p27、cyclinA购自美国CST公司；Bcl-2、Lipofectamine®2000、Superscript RNase H-逆转录酶购自美国Invitrogen公司；MLK4购于英国Abcam公司；RNA purification system购于德国Qiagen公司；DNase-Ⅰ购于瑞士Roche公司；Superscript RNase H-逆转录酶和随机六聚体购于Sigma-Aldrich公司；SYBR Green Master Mix购于美国Thermo Fisher公司；CO2培养箱购于美国Thermo Fisher公司；ABI Prism 7000系统购于美国Applied Biosystems公司。

1.3 细胞培养膀胱癌5637细胞保存于含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2的湿化培养箱中培养。

1.4 细胞转染准备5637细胞。miR-411-3p模拟物或pcDNA-MLK4的单独转染：使用Lipofectamine® 2000将miR-411-3p模拟物转染到5637细胞系中，严格按照制造商的使用说明进行。转染48 h后，用实时定量聚合酶反映(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测转染效率。模拟物和过表达载体的联合转染：将mimic+pc-GSKIP与转染试剂充分混合，25 min后与细胞孵育8 h。48 h后，收集5637细胞。

1.5 RT-qPCR总RNA用RNA purification system提取。用DNase-Ⅰ去除基因组DNA。用Superscript RNase H-逆转录酶和随机六聚体从5 mg总RNA中制备cDNA。对于RT-qPCR，在ABI Prism 7000系统中，使用SYBR Green Master Mix和引物在优化浓度下测定基因表达。miR-411-3p引物序列5’-TAGTAGACCGTATAGCGTACG-3’；MLK4正向引物5’-CTAGTGCCTATGGCGTGGA-3’,反向引物5’-TCCGGCTATCTTACCTTCTCAT-3’；GAPDH正向引物：5’-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3’，反向引物：5’-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3’。每个基因均生成标准曲线，扩增效率为90%～100%。通过阈值比较，确定基因表达的相对定量。所有结果均以GAPDH为基准进行归一化。

1.6 双荧光素酶报告基因实验Targetscan 7.0推测MLK4和miR-411-3p之间的靶点。将MLK4的3’UTR片段(wt和mut)构建成荧光素酶报告载体(pmirGLO；美国Promega)。此后，细胞分别单独或联合miR-181c-5p mimic转染lucg-GSKIP-wt或Luc-GSKIP-mut。荧光素酶活性由双荧光素酶报告试剂盒(Promega,USA)测定。

1.7 克隆形成实验将不同处理组的5637细胞接种于6孔板中，每孔200个细胞，连续接种7 d。废弃培养基，每个孔用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)仔细洗2次。将菌落在甲醇中固定20 min，然后用吉姆萨(Giemsa)染色液染色。统计≥50个细胞的菌落数，计算菌落形成效率(菌落百分比=菌落形成数/接种细胞数×100%)。

1.8 蛋白质印迹法(Western blot)用BCA法检测组织中的蛋白。SDS-PAGE电泳法分离蛋白，电转移至PVDA膜上。用体积分数为5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)阻断后，用一抗(MLK4、Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、p53、p27、cyclinA、GAPDH)在4 ℃孵育过夜。然后将膜与羊抗兔IgG-HRP在室温下孵育45 min。最后，用ECL试剂盒检测条带。信号通过Image LabTM软件进行分析。

1.9 流式细胞术检测凋亡在4 ℃下用体积分数为70%的乙醇将膀胱癌5637细胞固定过夜。然后加入10 mg/mL RNase A和碘化丙啶(PI)于4 ℃染色过夜。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒按照说明书使用流式细胞仪(美国BD公司)检测细胞凋亡率。Annexin V-FITC(-)/PI(-)为正常细胞，Annexin V-FITC(+)/PI(-)细胞为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC(+)/PI(+)为晚期凋亡细胞。Annexin V(-)/PI(+)坏死。所有实验重复3次，最终结果取平均值。

2 结 果

2.1 miR-411-3p在膀胱癌组织和膀胱癌5637细胞系中低表达通过RT-qPCR检测了膀胱癌组织和膀胱癌5637细胞系中miR-411-3p的表达。如图1所示，与对照组比较，膀胱癌组织和5637细胞中的miR-411-3p表达均显著下调(P<0.05)，说明miR-411-3p在膀胱癌中低表达。

A：在膀胱癌组织及其癌旁组织的表达；B：在人正常膀胱上皮细胞及膀胱癌5637细胞中的表达(*P<0.05)。图1 miR-411-3p在膀胱癌组织和其细胞系5637中的表达

2.2 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4转染膀胱癌5637细胞的转染效率本研究使用miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4分别转染膀胱癌5637细胞。与对照组相比，miR-411-3p mimic组的miR-411-3p水平显著升高(P<0.05)，而MLK4的mRNA相对表达显著降低(P<0.05，图2A、B)；pcDNA-MLK4组的MLK4的mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05，2C、D)。由此可见，miR-411-3p和MLK4过表达成功，且miR-411-3p与MLK4在膀胱癌细胞中呈负向表达。

A：miR-411-3p mimic转染5637细胞后miR-411-3p的相对表达；B：miR-411-3p mimic转染5637细胞后MLK4的相对表达；C：pcDNA-MLK4过表达质粒转染5637细胞后MLK4的mRNA相对表达；D：pcDNA-MLK4过表达质粒转染5637细胞后MLK4的mRNA相对表达(*P<0.05)。图2 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4分别转染5637细胞后的表达情况

2.3 miR-411-3p靶向调控MLK4基因我们将miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4联合转染膀胱癌5637细胞，进一步考察miR-411-3p和MLK4基因的关系。与对照组比，miR-411-3p mimic组的MLK4 mRNA水平显著降低(P<0.05)，而pcDNA-MLK4组的MLK4 mRNA水平显著升高(P<0.05)；与pcDNA-MLK4组比，mimic+MLK4组的MLK4 mRNA水平显著回降(P<0.05，图3)。同样，我们在蛋白水平也得到了一致的结果。与对照组比，miR-411-3p mimic组的MLK4蛋白水平显著降低(P<0.05)，而pcDNA-MLK4组的MLK4蛋白水平显著升高(P<0.05)；与pcDNA-MLK4组比，mimic+MLK4组的MLK4蛋白水平显著回降(P<0.05，图3B)。我们通过TargetScan预测miR-411-3p靶向MLK4 3’UTR 2381-2387的位置，进一步通过双荧光素酶实验证实miR-411-3p和MLK4基因的关系。如图3D所示，在Luc-MLK4-wt(野生型)中，与miR-NC组比，miR-411-3p组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而在Luc-MLK4-mut(突变型)中，与miR-NC组比，miR-411-3p组的荧光素酶活性无显著改变(P>0.05，图3C)。由此可见，在膀胱癌5637细胞中，MLK4是miR-411-3p的靶基因。

A：miR-411-3p和MLK4分别或共转染5637细胞后MLK4的mRNA相对表达；B：miR-411-3p和MLK4分别或共转染5637细胞后MLK4的蛋白相对表达；C：TargetScan预测miR-411-3p与MLK4的靶位点；D：双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系(与对照组比，*P<0.05；与pcDNA-MLK4组比，#P<0.05)。图3 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4共转染5637细胞后miR-411-3p和MLK4的表达

2.4 miR-411-3p通过靶向调控MLK4抑制膀胱癌5637细胞的增殖克隆形成实验结果表明，与对照相比，miR-411-3p mimic组的克隆形成率显著降低(P<0.05)，而pcDNA-MLK4组的克隆形成率显著升高(P<0.05)；与pcDNA-MLK4组比，mimic+MLK4组的克隆形成率显著回降(P<0.05，图4A、B)。同时，我们还检测了增殖相关蛋白Ki67和PCNA。Western blot实验结果表明，与对照相比，miR-411-3p mimic组的Ki67和PCNA蛋白水平显著降低(P<0.05)，而pcDNA-MLK4组的Ki67和PCNA蛋白水平显著升高(P<0.05)；与pcDNA-MLK4组比，mimic+MLK4组的Ki67和PCNA蛋白水平显著回降(P<0.05，图4C)。由此可见，miR-411-3p通过靶向调控抑制了膀胱癌5637细胞增殖。

2.5 miR-411-3p通过靶向调控MLK4促进膀胱癌5637细胞的凋亡流式细胞术结果表明，与对照组相比，miR-411-3p mimic组的细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，而pcDNA-MLK4组的细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与pcDNA-MLK4组比，mimic+MLK4组的细胞凋亡率显著回升(P<0.05，图5A)。同时，我们还检测了凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2。Western blot实验结果表明，与对照相比，miR-411-3p mimic组的Bax/Bcl-2比值显著升高(P<0.05)，而pcDNA-MLK4组的Bax/Bcl-2比值显著降低(P<0.05)；与pcDNA-MLK4组比，mimic+MLK4组的Bax/Bcl-2比值显著回升(P<0.05，图5B)。由此表明，miR-411-3p通过靶向调控MLK4促进膀胱癌5637细胞凋亡。

A、B：克隆形成实验，吉姆萨染色(×200)，与对照组比，*P<0.05；与pcDNA-MLK4组比，#P<0.05；C：Ki67和PCNA蛋白的相对表达。图4 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4分别或共转染5637细胞后的增殖情况

A：流式细胞术检测凋亡；B：Bax和Bcl-2蛋白的相对表达(与对照组比，*P<0.05；与pcDNA-MLK4组比，#P<0.05)。图5 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4分别或共转染5637细胞后的凋亡情况

2.6 miR-411-3p通过靶向调控MLK4阻碍膀胱癌5637细胞周期进程最后，我们还考察了与细胞周期相关的蛋白：p53、p27和cyclinA。Western blot结果表明，与对照相比，miR-411-3p mimic组的p53和p27蛋白水平显著升高(P<0.05)，而cyclinA蛋白水平显著降低(P<0.05)；pcDNA-MLK4组的p53和p27蛋白水平显著降低(P<0.05)，而cyclinA蛋白水平显著升高(P<0.05)。与pcDNA-MLK4组比，mimic+MLK4组的p53和p27蛋白水平显著回升(P<0.05)，而cyclinA蛋白水平显著回降(P<0.05)。由此可见，miR-411-3p通过靶向调控MLK4阻碍膀胱癌5637细胞周期进程(图6)。

图6 Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达

3 讨 论

膀胱癌的发病机制复杂，涉及大量基因表达、蛋白功能障碍和多种信号通路。目前，膀胱癌发生的分子遗传机制尚不清楚。近年来，miRNA在膀胱癌发生发展中的作用和意义越来越受到重视[12-14]。

已有报道称，miR-411-3p在卵巢癌细胞系中低表达[10]。也有研究指出，lncRNA TTN-AS1在口腔鳞状细胞癌样本和细胞中的表达增强，而其作为miR-411-3p的海绵，抑制miR-411-3p的表达[15]。本研究发现，miR-411-3p在膀胱癌组织和膀胱癌5367细胞系中呈现低表达。

混合谱系激酶4(MLK4)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于MLK家族[16]。对MLK在肿瘤发生中的作用的认识不断累积。MLK4已被证明可以抑制MAPK通路(包括p38、JNK和ERK)的激活，负调控MLK3激酶活性，并在卵巢癌中作为细胞侵袭的抑制因子[17-18]。还有研究报道，MLK4上调表达促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭[19]。也有报道称，MLK4的下调表达可通过调节ROS/MAPKs信号通路抑制HCC的转移并诱导凋亡[16]。XI等[20]揭示，MLK4通过抑制JNK信号通路促进胃癌发生。这些发现强调了MLK4的促肿瘤活性。本研究发现，在膀胱癌5637细胞中，miR-411-3p过表达抑制了MLK4的表达，两者呈现负相关。进一步证实，miR-411-3p靶向MLK4基因。在5637细胞中，MLK4使增殖相关的Ki67和PCNA表达上调，促进细胞克隆形成。MLK4使凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2表达下调，抑制细胞凋亡。MLK4也使调控染色体复制的cyclinA表达明显升高；而使阻滞细胞周期的p53和p27表达降低，由此加速细胞周期进程。但miR-411-3p过表达后，靶向MLK4，抑制其表达，抵消了MLK4产生的上述效应。

综上所述，miR-411-3p可通过靶向MLK4基因，抑制膀胱癌5637细胞增殖并抑制其凋亡，阻滞细胞周期。miR-411-3p对膀胱癌细胞的作用提示可能为寻找治疗膀胱癌的潜在新药提供新的思路。