基于网络药理学探讨红核妇洁洗液抗炎的活性成分和作用机制

饶鸿宇，李沛波，谌攀，何彦，苏薇薇

(中山大学生命科学学院，广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心/广东省热带亚热带植物资源重点实验室，广东 广州 510275)

红核妇洁洗液是以山楂核为原料，经高温干馏制得的妇科外用洗剂，具有杀虫止痒、解毒祛湿的功效。现代药理学研究表明，红核妇洁洗液对琼脂致小鼠肉芽肿增生和二甲苯致小鼠耳肿胀均存在良好的抑制作用，具有减轻炎症反应的功效，临床上主要用于各种原因引起的女性阴道炎[1-2]。本团队前期研究阐明了红核洗液的物质组成，但对其药效关键物质有待进一步发掘[3-4]。

中药网络药理学从医学和化学等角度系统的探讨了药物与疾病间的关联性，并运用计算机预测药物的药理学模型，构建“药物-靶点-疾病” 网络，揭示药物的作用机制，为中药多成分、多靶点和多途径的复杂作用机制提供新的研究方向[5-6]。目前已有多个数据库可提供中药成分和作用靶点等信息，在中药药理学研究和中医药现代化方面发挥了良好的作用。本研究首次采用网络药理学方法研究红核妇洁洗液抗炎的活性成分和机制，为红核妇洁洗液的临床应用提供科学依据。

1 方法

1.1 化学成分的收集 本团队前期基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)对红核妇洁洗液进行了化学物质基础的研究，共确证和指认了92个化合物，其中酚类化合物26个，醛酮类化合物24个，醇醚类化合物13个，有机酸类及其酯类化合物11个，呋喃及其他含氧杂环类化合物11个，其他化合物7个，明确了红核妇洁洗液的化学组成[3-4]。

1.2 交集靶点的确定及药材-活性成分-交集靶点网络的构建 通过SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)基于结构相似性预测化合物的靶点，再结合CTD(https://ctdbase.org/)和TCMSP(http://tcmspw.com/)检索活性化合物的靶蛋白或靶标基因，借助Drugbank(https://www.drugbank.ca/)和 Uniprot(https://www.uniprot.org/)等数据库查阅靶蛋白对应的基因名。以“inflammation”为关键词在DisGeNET(http://www.disgenet,org/)数据库中搜索炎症相关的靶点。将红核妇洁洗液的药物成分靶点与DisGeNET数据库中获得的疾病靶点进行对应，获得交集靶点，并绘制Venn图。根据交集靶点结果，筛选与交集靶点对应的功效成分后，运用Cytoscape3.7.2构建可视化的药材-活性成分-交集靶点网络，并分析网络的拓扑特征。

1.3 交集靶点功能富集分析和通路富集分析 为进一步解析上述筛选出的靶基因的功能，预测红核妇洁洗液的作用机制，将筛选得到的交集靶点导入DAVID v6.7数据库(https://david.ncifcrf.gov/)并限定物种为人(Homo sapiens)，进行GO功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路富集分析。

2 结果

2.1 化学成分的收集及交集靶点的筛选 通过CTD和TCMSP数据库和靶点预测共搜集到红核妇洁洗液成分作用的潜在靶点1 056个，通过DisGeNET数据库查询现有报道抗炎作用靶点共467个，两者整合后得到交集靶点143个(见图1)，视为红核妇洁洗液抗炎的预测靶点，通过Cytoscape分析，明确了与预测靶点相关的活性成分共84个，其中酚类化合物24个，醛酮类化合物24个，醇醚类化合物11个，有机酸类及其酯类化合物10个，呋喃及其他含氧杂环类化合物8个，其他化合物7个，用于后续网络构建。

图1 红核妇洁洗液成分潜在靶点与炎症靶点Venn图

2.2 交集靶点筛选和药材-成分-交集靶点网络分析 利用Cytoscape 建立的药材-成分-交集靶点网络见图2。由图2可知，该网络共有227个节点(84个成分，143个交集靶点)，1 392条边。在143个交集靶点中，Degree值前15的靶点为CYP19A1、PARP1、IDO1、JAK2、ALPL、ALOX5、NOS2、EGFR、CDK5、PTGS2、HSP90AA1、CHRNB2、CHRNA4、NOS3和NAT1。Degree值前5的成分是eugenol(丁香酚)、2-methoxy-4-(1-propenyl)-phenol(异丁香酚)、2-methyl-1H-benzimidazole(2-甲基苯并咪唑)、2-methoxy-phenol(愈创木酚)和coniferyl aldehyde(松柏醛)。

2.3 交集靶点通路分析 运用DAVID平台的GO富集分析和KEGG通路分析的功能，对红核妇洁洗液中的143个交集靶点进行研究。通过GO富集分析确定了645个GO条目(P<0.05)。由图3可知，生物过程相关的条目有522个(81%)，主要涉及炎症反应、对脂多糖的反应、缺氧反应、一氧化氮生物合成过程的正向调控、平滑肌细胞增殖的正向调控、细胞信号转导、ERK1和ERK2级联反应的正向调节、炎症反应的正向调节、脂多糖介导的信号通路和免疫应答等方面；分子功能相关的条目有72个(11%)，主要涉及酶结合、细胞因子活性、蛋白结合、受体结合、趋化因子活性、血红素结合、丝氨酸型内肽酶活性、相同的蛋白结合、蛋白激酶绑定和类固醇激素受体活性等方面；细胞组成相关的条目有51个(8%)，主要涉及细胞外空间、细胞表面、细胞外区域、细胞质膜、质膜组成部分、质膜外侧、膜筏、细胞膜小窝、细胞基质和细胞膜等方面。通过KEGG通路分析共筛选到 107条通路(筛选P<0.05的通路，P值越小，富集程度越高)。图4为列举的前25条相关通路，主要包括肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体(TLR)信号通路和细胞因子之间的相互作用等。

图4 红核妇洁洗液交集靶点KEGG通路富集分析结果

3 讨论

红核妇洁洗液是以山楂核为原料制成的外用洗液，具有抗炎效果好，毒副作用小的特点，是妇科临床常见的抗菌消炎药之一。现阶段研究表明红核妇洁洗液对于多种致病菌具有良好的抑制作用，与临床效果相一致，然而其抗炎机制方面的研究却较为少见。

本研究采用网络药理学对红核妇洁洗液中的化学成分进行研究，系统地分析了红核妇洁洗液的92个化合物。其中，有72个化合物至少10个以上的靶点相关，分值从高到低排序的化合物依次为丁香酚、异丁香酚、2-甲基苯并咪唑和愈创木酚等，其中排名最高的是丁香酚，为49个。丁香酚是一种从植物精油中提取得到的酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性，多项研究表明丁香酚可以改善LPS和汽车尾气等引起的肺损伤，降低IL-6等炎症因子水平；还可以通过作用于MAPKs和AKT/IκBα信号通路，抑制一氧化氮合酶的表达，降低巨噬细胞的NO水平，发挥抗炎的功效[7-9]。异丁香酚是丁香酚的异构体，Kaur等[10]发现异丁香酚能抑制COX-2和iNOS的表达，降低PGE2和NO水平，缓解弗氏试剂引起的大鼠关节炎症状；还能减弱LPS对小鼠腹膜巨噬细胞的刺激，减少TNF-α的含量，发挥抗炎作用。Johansson等[11]对麦芽提取物进行研究，发现愈创木酚具有缓解橄榄油诱发的小鼠足垫炎症的功效。Akram等[12]运用细胞模型和动物模型对松柏醛的抗炎活性进行研究，结果表明松柏醛能抑制JAK2-STAT1-iNOS信号通路，降低NO水平，还能缓解角叉菜胶引起的大鼠足部水肿和佛波醇肉豆蔻酸酯引起的小鼠耳部水肿，具有良好的抗炎功效。由此可见，红核妇洁洗液中的丁香酚、异丁香酚和愈创木酚等在动物实验和细胞水平上均表现出良好的抗炎作用。

在“成分-靶点网络图”分析过程中，红核妇洁洗液预测的143个靶点中，有55个靶点与至少10个以上的化合物相关，占38.46%，分值从高到低排序的靶点依次为CYP19A1、PARP1、IDO1、JAK2和ALPL等。CYP19A1是细胞色素P450家族中的一员，具有催化雌激素等类固醇激素生成的作用，多项研究表明LPS刺激引起的炎症与CYP19A1的表达存在相关性[13-14]。此外，Qin等[15]发现CYP19A1的表达与TNF-α的分泌也存在一定的联系。IDO1是一种色氨酸分解酶，可以抑制适应性T细胞的免疫应答，诸多研究表明抑制IDO1的表达可以减轻炎症反应[16-18]。Ho等[19]对IDO1的抗炎机制进行研究，发现被TNF-α等炎症因子活化的IDO1可以促进AhR水平的提升，激活巨噬细胞和单核细胞，加重炎症反应。JAK2是酪氨酸蛋白激酶家族中的成员，可激活JAK/STAT通路，在细胞增殖、分化和凋亡等信号传导过程中发挥了关键的作用。Chen等[20]对蛙皮素刺激的大鼠胰腺细胞进行研究，发现阻断JAK2/STAT3信号通路可导致IL-6和TGF-1水平降低，减少细胞死亡。与此同时，多项研究表明JAK2/STAT3信号通路还可以促进巨噬细胞极化，加重炎症反应[21-23]。因此，红核妇洁洗液可作用于CYP19A1、IDO1和JAK2等靶点，发挥抗炎的功效。

通过生物功能富集分析和KEGG信号通路分析，发现红核妇洁洗液涉及多项生物过程和信号通路，尤其是炎症反应、TNF信号通路和缺氧反应等，在抗炎过程中起到重要的作用。TNF是与炎症反应密切相关的细胞因子家族，活化的TNFR可以促进IL-1、IL-6和IL-10等炎症因子的释放，还能激活MAPK-JNK和NF-κB等多条信号通路，活化与机体炎症相关的5-脂氧合酶和磷脂酶A2等多个蛋白，加重机体的炎症反应[24]。诸多研究发现药物可通过作用于TNF信号通路和LPS信号通路等，下调IL-1β、IL-6和等TNF-α炎症因子水平，减轻机体炎症反应，促进康复[25-26]。HIF-1常在低氧、生长因子和癌基因等因素的刺激下完成活化，也可被活化的Akt激活，维持组织和细胞的内环境稳定，使细胞适应缺氧状态。活化后的HIF-1α具有增加巨噬细胞迁移抑制因子的分泌，促进巨噬细胞的聚集和侵袭；激活PD-L1等配体，促进B细胞的成熟和T细胞的活化；调节细胞因子的表达，促进炎症性淋巴管中淋巴管再生；促进炎症条件下树突状细胞的成熟的作用[27-28]。有研究发现药物可以通过抑制HIF-1途径，改善缺氧条件和氧化应激下诱导的细胞炎症，改善机体功能[29-30]。因此，红核妇洁洗液可从减少炎症因子分泌，改善氧化应激和促进免疫功能等方面发挥加速炎症的消退，促进患者康复。

综上所述，红核妇洁洗液中的活性成分群可通过多靶点多通路减轻炎症反应，还能调节机体免疫功能，改善氧化应激和缺氧反应，促进患者的康复。本研究阐明了红核妇洁洗液抗炎的活性成分及作用机制，为红核妇洁洗液的临床应用提供了科学的依据。