QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法检测中药砂仁中10种氨基甲酸酯类农药残留

2021-03-01张振山乐渊黎舒怀刘春华李萍萍

安徽农业科学 2021年1期

张振山乐渊黎舒怀刘春华李萍萍

摘要 [目的]建立QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱检测砂仁中10种氨基甲酸酯类农药残留量的方法。[方法]砂仁样品先用含1%甲酸的乙腈溶液提取，再经盐析剂盐析后加入MgSO4、PSA和C18进行萃取、净化，采用UPLC-MS/MS检测，基质匹配标准曲线外标法进行定量。[结果]目标化合物在2.5～100.0 μg/L有良好的线性关系，R2≥0.999;在0.02、0.08和0.40 mg/kg 3个添加水平下，10种农药成分加标回收率为70.7% ～ 113.3%，RSD为0.2%～4.9%（n=3）;定量限（LQD）在0.19～4.01 μg/kg。[结论]该方法操作简单、净化效果好、灵敏度高、准确度高，适用于砂仁药材中10种氨基甲酸酯类农药的残留检测。

关键词砂仁;氨基甲酸酯类农药;QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱

中图分类号 S481+.8 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）01-0199-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.053

Abstract [Objective]To establish a method for the simultaneous determination of 10 carbamate pesticide residues in Amomum villosum Lour. by QuEChERS-ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. [Method]The samples were extracted with acetonitrile （containing 0.1% formic acid）and followed by salting-out process， the extract was further purified by C18， PSA and anhydrous magnesium sulfate. The prepared samples were then analyzed by UPLC-MS/MS and quantified by the matrix-matched standard calibration curve method. [Result]The target compound had a good linear relationship between 2.5-100.0 μg/L， R2≥0.999;at spiked levels of 0.02，0.08 and 0.40 mg/kg， the average recoveries of all the pesticides were 70.7% - 113.3%， and the RSD was 0.2% -4.9%（n =3） . The limits of detection（LOD） was 0.19 - 4.01 μg/kg. [Conclusion]The method has simple operation， good purification effect， high sensitivity and high accuracy， and is suitable for the detection of 10 carbamate pesticide residues in Amomum vilosum Lour..

Key words Amomum villosum Lour.;Carbamate pesticide;QuEChERS-UPLC-MS/MS

砂仁是姜科植物阳春砂（Amomum villosum Lour.）、绿壳砂（Amomum villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen）或海南砂（Amomum longiligularg T.L.wu）的干燥成熟果实，为四大南药之一，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效，主要用于湿浊中阻、脘痞不饥、脾胃虚寒、呕吐泄泻、妊娠恶阻、胎动不安等病症[1]，在治疗消化系统等方面的疾病具有很独特的功效[2]。随着砂仁药材的需要量逐年增加，砂仁的人工种植面积也在逐渐扩大，药材的农药滥用误用现象也时有发生[3]。

氨基甲酸酯类农药是在有机磷类农药之后发展起来的一种合成农药，作为杀虫剂、除草剂和杀菌剂广泛应用于农业生产中，具有高效、低残留的特点[4]。然而，在中药材的害虫防治过程中也易产生农药残留，不仅会污染水体、土壤，破坏生态结构，也会影响临床用药健康，对人类的健康产生危害[5]。笔者拟采用 QuEChERS 净化工艺，优化提取与净化方法，旨在建立砂仁中10种氨基甲酸酯类农药残留的检测方法，满足砂仁中氨基甲酸酯类农药的日常检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备。

TE412-L电子天平（德国赛多利斯公司）;XW-80A微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器有限公司）;MS 3 basic 型振荡器（德国 IKA 公司）;VS-24SMT高速大容量离心机（美国VISION公司）;Triple Quad 4500液相色谱三重四极杆串联质谱仪（美国SCIEX公司）。

1.1.2 试剂。

甲醇、乙腈、甲酸（色谱级，美国Fisher公司）;氯化钠、醋酸铵、无水硫酸镁均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅胶键合相（C18）购于美国 Agilent 公司;超纯水以美国Millipore公司Milli-Q超純水系统制备获得;0.22 μm微孔滤膜购自安谱实验科技（上海）股份有限公司。

标准物质：抗蚜威、异丙威、霜霉威、克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、甲萘威、灭多威（1 000 μg/mL，农药标准品购自天津农业部环境质量监督检验测试中心）。

1.1.3 试材。

试验所用16批砂仁样品来自于广东、云南、广西、海南的药材基地和药材市场，经海南省乐东黎族自治县热作办公室陈祥军老师鉴定，均为姜科豆蔻属植物砂仁的果实。样品经粉碎机粉碎后，过3号筛（药典筛，50目），装于密封袋中，置干燥器中保存、备用。

1.2 方法

1.2.1 样品的前处理。

1.2.1.1 提取。准确称取5.00 g试样，置于100 mL离心管中，加入4 g氯化钠和2 g无水硫酸钠，再加入20.0 mL乙腈（含1%甲酸），浸泡15 min，3 000 r/min涡旋振动1 min，再以5 000 r/min离心5 min。

1.2.1.2 净化。取上层溶液5.0 mL于预先加有1 000 mg MgSO4、200 mg PSA及200 mg C18的离心管中，涡旋混匀1 min，再以5 000 r/min离心5 min 。吸取上清液1.0 mL与1.0 mL甲醇水溶液（50%）1∶1混合均匀，过0.22 μm微孔滤膜，经UPLC-MS/MS上机分析。

1.2.2 标准溶液的配制。

1.2.2.1 标准储备溶液。取10种氨基甲酸酯类标准物质，分别精密吸取1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 mg/L的各农药标准储备液，-18 ℃保存。

1.2.2.2 混合标准溶液。精密吸取0.1 mL上述标准储备溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1.00 mg/L的混合标准溶液，-18 ℃保存。

1.2.2.3 混合标准工作液。分别精密吸取1.00 mg/L的混合标准溶液0.05、0.10 、0.20 、0.40 、1.00和2.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇水溶液（50%）定容，配制成0.005、0.010、0.020、0.040、0.100和0.200 μg/mL的系列浓度的标准工作液。

1.2.2.4 基质混合标准工作液。准确称取5.00 g空白砂仁样品各5份，按“1.2.1”的方法进行前处理试验，吸取上清液和混合标准工作液按体积比1∶1混合均匀，配制成0.002 5、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0和0.100 0 μg/mL的基质混合标准工作液。

1.2.3 仪器工作条件。

1.2.3.1 色谱条件。

色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm），1.7 μm ，柱温35 ℃，进样量5 μL。流动相A为1.0 mmol/L乙酸铵溶液（pH=4.5），流动相B为甲醇，流速为0.25 μg/min。梯度洗脱程序，0～1.0 min，90% A;1.0～2.0 min，90%～30% A;2.5～4.0 min，30%A;4.0～5.0 min，30%～5% A;5.0～9.0 min，5% A;9.0～9.1 min，5%～90% A;9.1～10.0 min，90% A。流速0.25 μg/min。

1.2.3.2 质谱条件。

离子源：ESI源，正离子模式;离子源温度：550 ℃;毛细管电压：5.5 kV;雾化气压力：344.7 kPa;去溶剂气压力：413.7 kPa;气帘气压力：72.4 kPa;碰撞气压力：55.2 kPa;检测模式：多反应监测（MRM）模式。MRM模式下10种农药的质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 UPLC-MS/MS分析参数的优化

在ESI源正离子模式下，以10种氨基甲酸酯类农药的单标溶液作为调试液进行手动调谐，优化各化合物的母离子和子离子，每个化合物选取2组灵敏度较高的离子对作为定量离子和定性离子，并获得最佳的锥孔电压和碰撞能量等参数，结果见表1。

取0.02 μg/mL的混合标准工作溶液，经UPLC-MS/MS上机，获得10种氨基甲酸酯类农药成分的总离子流色谱图（图1）和MRM色谱图（图2），在10 min内，可完成上述农药的分析，对应的保留时间见表1。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性关系考察。取“1.2.2.4”中的基质混合标准工

作溶液，经UPLC-MS/MS分析，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果表明，10种氨基甲酸酯类农药在2.5～100.0 μg/L线性关系良好，R2≥0.999（表2）。称取空白砂仁样品，加入标准溶液进行样品添加试验，按照“1.2.1”方法进行前处理试验并上机，以3倍信噪比（S/N）计算砂仁中10种农药的检出限，各农药的方法检出限在0.06～1.20 μg/kg（表2），根据10倍信噪比计算理论定量限在0.19～4.01 μg/kg。

2.2.2 精密度试验。

取“1.2.2.4”中的基质混合标准工作溶液，按“1.2.3”仪器工作条件，连续进样6针，记录色谱图峰面积，结果发现，抗蚜威、异丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、甲萘威和灭多威峰面积的RSD值分别为0.5%、0.2%、0.5%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验。

取“1.2.2.4”中的基质混合标准工作溶液，按“1.2.3”仪器工作条件，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样，记录色谱图峰面积，结果发现，抗蚜威、异丙威、霜霉威、克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、甲萘威和灭多威峰面积的RSD值分别为4.4%、2.7%、2.6%、7.7%、7.2%、4.7%、5.9%、2.2%、1.7%、7.1%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.2.4 重复性试验。

称取编号1的药材6份，按照“1.2.1”提取方法，以0.40 mg/kg作为添加浓度，做加样回收率试验，记录色谱图峰面积，结果发现，抗蚜威、异丙威、霜霉威、克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、甲萘威和灭多威峰面积的RSD值分别为0.5%、0.2%、0.5%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验。

选取0.02、0.08和0.40 mg/kg作为加样回收试验的3个添加浓度，取编号1的药材，按照“1.2.1”方法，计算10种农药回收率，每个水平平行测定3次，平均回收率和相对标准偏差RSD见表3。结果表明，10种农药残留的平均回收率为70.7%～113.3%;RSD为0.2%～4.9%，均满足定量分析要求。

2.3 样品测定

按照“1.2.1”样品前处理方法和“1.2.3”仪器分析条件，对采集的16批砂仁样品进行检测，每份样品平行测定2次，结果发现并未在样品中检测出10种氨基甲酸酯类农药的存在。

3 结论与讨论

3.1 提取方法的优化

砂仁作为常用的芳香化湿类中药，含有丰富的挥发性成分，如乙酰龙脑酯、樟脑、龙脑、月桂烯等，同时也含有多糖、脂肪酸、色素、鞣质等成分[6]，对砂仁的农药残留测定具有一定的干扰，不仅降低了仪器的灵敏度和准确度，还增加了仪器的维护成本。因此，在对样品检测前，需要对样品进行一定的净化处理。

QuEChERS是近年来应用于食品检测中十分普遍的一项前处理技术，具有快速、便捷、分析范围广、准确率高的特点[7]。该试验采用1%甲酸的乙腈溶液提取砂仁样品，再加入了PSA、C18作为吸附剂对提取液进行净化，以PSA吸附其中的有机酸、鞣质等极性成分，以C18去除其中的一些非极性成分，可以得到颜色较浅、无色澄清的待测溶液。

3.2 基质效应

基质效应（matrix effect，ME）是影响定量准确度的关键因素之一，会对目标化合物的准确定量造成较大影响。ME的评价方法常以基质标准曲线的斜率与溶剂标准曲线的斜率之比来进行评估，当ME值在80%～120%为无明显基质效应，在80%以下为基质抑制效应，在120%以上为基质增强效应[8]。

为提高分析方法的可靠性，试验对砂仁提取液的基质效应也进行了考察。配制砂仁基质匹配标准溶液和纯溶剂标准溶液进行仪器分析，绘制校正曲线，计算两者斜率之比，结果发现均小于80%，其中异丙威、3-羟基克百威和灭多威的斜率比分别为13.0%、19.4%、17.2%，说明均存在不同程度的基质抑制效应现象，因此，该试验采用砂仁基质匹配标准溶液进行定量分析。结果表明，10种农药在2.5～100.0 μg/L线性关系良好，R2≥0.999;在0.02、0.08和0.40 mg/kg 3個添加水平进行回收试验，10种农药回收率在70.7%～113.3%。

3.3 色谱条件的选择

目前测定食品中氨基甲酸酯的分析方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法以及生物检测法和生物传感器法[9]。由于氨基甲酸酯类化合物极性强、热稳定性差，目前以液相色谱-柱后衍生法和液相色谱-质谱法较为普遍[10]。液相色谱-柱后衍生法需要经柱分离后在线水解生成甲胺，再进行荧光衍生，定性手段比较单一，抗干扰能力弱，对于砂仁中农药的检测存在一定量的不足[11]。在中国药典2015版中，也有部分氨基甲酸酯类农药采用液相色谱-串联质谱法进行测定。该研究采用超高效液相色谱-串联质谱法检测砂仁，方法简便快捷、灵敏度高、基质效应小、准确度高，适用于砂仁中氨基甲酸酯类农药的检测。

3.4 样品测定

砂仁在国内的产地主要有广东、广西、云南、海南四省，随着临床使用量的扩大，野生资源逐渐减少，开始转为人工种植，其中以云南、广东产量较高，尤以云南省栽培面积最广[12]。但由于中药种植的基础设施较薄弱，规模化的中药种植易受到病虫害的影响，农药滥用乱用的现象时有发生[13-14]。该研究采集的16批药材中，经检测，并未有抗蚜威等10种氨基甲酸酯类农药的检出，通过回访，推测其原因为农户一般在砂仁的苗期对叶片进行农药喷施，果期施用较少。但建立砂仁中氨基甲酸酯类农药的QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱检测方法，为砂仁中氨基甲酸酯类农药的防控监测提供了一项重要的技术手段，也可以为姜科同属的其他作物和药材的检测提供技术依据。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：169.

[2]陆山红，赵荣华，幺晨，等.砂仁的化学及药理研究进展[J].中药药理与临床，2016，32（1）：227-230.

[3]陈彩英，詹若挺，王小平.砂仁品种、种质资源的考证溯源[J].山东中医药大学学报，2011，35（4）：354-357，376.

[4]崔伟伟，张强斌，朱先磊.农药残留的危害及其暴露研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（2）：883-884，889.

[5]卜元卿，孔源，智勇，等.化学农药对环境的污染及其防控对策建议[J].中国农业科技导报，2014，16（2）：19-25.

[6]鲁艺，申丽，王洋，等.砂仁挥发油中7种活性成分的含量测定研究[J].药物分析杂志，2016，36（9）：1536-1543.

[7]刘亚伟，董一威，孙宝利，等.QuEChERS在食品中农药多残留检测的应用研究进展[J].食品科学，2009，30（9）：285-289.

[8]苏萌，艾连峰.液相色谱-串联质谱基质效应及其消除方法[J].食品安全质量检测学报，2014，5（2）：511-515.

[9]谭彦，蒋屏，陈传品.食品中氨基甲酸酯类农药残留检测方法的研究进展[J].科技风，2019（15）：221.

[10]黄志强.食品中农药残留检测指南[M].北京：中国标准出版社，2010.

[11]张艳侠，张婷，薛霞，等.QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中17种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留[J].分析试验室，2019，38（1）：13-18.