miR-146a通过靶向CCNJ调控鼻咽癌细胞HNE-1/DDP对顺铂敏感性的影响

周兰柱，赵报，张明洁，崔忆旋，吴俊，孙哲，柳申成，王文忠

蚌埠医学院第一附属医院耳鼻喉头颈外科，安徽 蚌埠 233000

鼻咽癌是我国高发病率的头颈部恶性肿瘤之一，起源于鼻咽黏膜上皮。它在亚洲具有明显的地理分布特征，特别是在我国的广东省，年发病率从每10万人中15至50例不等[1]。虽然近年来窄带成像内镜对鼻咽癌的诊断有了极大的帮助[2]，但由于鼻咽癌发病部位隐蔽，且具有高侵袭、高转移的特点，多数患者因颈部淋巴结转移而就诊，故而发现时已至中晚期。目前鼻咽癌多采用放射治疗、化学治疗或同步放化疗，已实现较为不错的局部控制[3]，但最终治疗结果和预后不尽如人意，且化疗后会产生细胞耐药，导致鼻咽癌患者预后较差，后期容易出现复发和转移[4]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一种单链、具有19～25个核苷酸的非编码小RNA的超家族，可以结合其靶基因的3'非翻译区（3'-UTR），导致mRNA切割或/和翻译抑制，从而使靶蛋白的表达水平发生改变。研究表明，miRNA参与各种生物过程的调节，包括胚胎发育，细胞周期，分化，增殖，迁移和凋亡[5,6]。近年来，miRNA在治疗肿瘤以及肿瘤细胞耐药方面崭露头角[7～9]，miR-146a已经被证明具有抑制多种肿瘤细胞侵袭和迁移能力，例如宫颈癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌以及肺癌等[5,10～13]。然而，还没有HNE-1/DDP细胞上调miR-146a的相关报道。本研究分析上调miR-146a对HNE-1/DDP细胞对顺铂（DDP）敏感性的作用及可能机制，为临床DDP耐药的鼻咽癌患者增加新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

人鼻咽癌耐DDP细胞株HNE-1/DDP购自中南大学湘雅医学院，RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶（含EDTA）购自上海生工，苯甲基磺酰氟化物（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）购自上海碧云天公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自浙江天杭生物科技股份有限公司，Opti-MEM培养基购自美国Gibco公司，顺铂（DDP）粉剂由美国Sigma公司生产，脂质体Lipofectamine 2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，增强型化学发光底物（enhanced chemiluminescent，ECL）试剂盒购自美国Pierce公司，双染细胞凋亡检测试剂盒（Annexin VFITC/PI）、BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天公司，miR-146a类似物、阴性对照序列购于上海吉玛公司，SYBR Premix Ex Tap TM试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，MRP1、P-gp、β-actin、CCNJ抗体购自美国CST公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 取出冻存的HNE-1/DDP细胞，放入37℃水浴锅中来回摇动使其融化，细胞悬液转移到无菌离心管中，离心机900 r/min离心4 min，弃上清，加入8 ml培养基包含10%FBS和1μg/ml DDP，移至培养皿，放入5%CO2恒温细胞培养箱中。为保持细胞的耐药性，培养过程中持续使用含DDP的RPMI培养基，若需进行细胞实验，提前48 h使用无DDP的培养基进行培养。

1.2.2 细胞转染 选取对数期生长的HNE-1/DDP细胞接种于6孔板中，分为空白组、阴性对照组、mimicsmiR-146a组。各组细胞生长至70%时，开始进行mimics-miR-146a组、阴性对照组的转染，具体步骤为：根据说明书，将8μl miR-146a类似物、阴性对照物（NC）分别加入含有400μl RPMI培养液的无酶EP管中，混匀静置5 min后分别与lip 2000混匀，静置20 min，分别加入6孔板，空白组只加入lip 2000，用RPMI培养液将每孔体积调整至2 ml，重复3次。将细胞置入细胞培养箱中继续培养，8 h后更换为含10%FBS但不含双抗的RPMI培养基继续培养。转染后24 h收集细胞进行MTT实验、Annexin V-FITC/PI双染实验，转染48 h后进行Western blot蛋白免疫印迹实验和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）。

1.2.3 MTT检测转染后HNE-1/DDP细胞对顺铂敏感性的变化 胰酶消化收集转染后空白组、NC组、mimics-miR-146a组的HNE-1/DDP细胞分别按5000个/孔接种于3个96孔板，培养24 h，吸去原培养液，按照每96孔板设置6个浓度梯度分别加入终浓度为（0、2、4、8、16、32）μmol/L的含DDP培养液，以不接种细胞而只加培养基的孔作为调零孔，以不加药的孔作为对照组，每个浓度设10个复孔，给药后培养48 h，检测其490 nm处吸光度。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 选取对数期生长的鼻咽癌HNE-1/DDP细胞，消化离心，每孔25×104个细胞接种于6孔板，待贴壁生长至70%开始转染，共分成3组，分别为空白组、阴性对照组、mimics-miR-146a组。转染后24 h，miR-146a孔、空白对照孔、阴性对照孔均加入8μmol/L DDP2 ml处理细胞，放回5%CO2恒温细胞培养箱中继续培养，24 h后用不含EDTA的胰酶消化细胞加入1.5 ml的离心管中，600 g/min离心5 min，PBS清洗两次，加入200μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入1.5μl Annexin V-FITC染色液混匀，避光冰浴15 min；加入1.5μl PI染色液，流式细胞仪测出细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.5 RT-qPCR检测细胞 将转染48 h的细胞从6孔板消化收集，PBS洗涤，1500 g/min离心5 min，弃上清，加入1 ml Trizol试剂，混匀后移至无RNA酶的1.5 ml EP管中，冰上裂解10 min，加入0.2 ml预冷的氯仿，剧烈震荡混匀约15 s，在冰上放置3 min，使用4℃离心机进行离心（12000 r/min，15 min）。取上层无色水相至无RNA酶EP管，加入异丙醇混匀，冰浴20 min，4℃离心机离心10 min（12000 r/min），可见白色沉淀，弃上清。使用预冷的75%无RNA酶的乙醇洗涤2次，室温干燥。加入0.1%DEPC水溶解后冰上保存。经Nano Vue TM Plus分光光度仪检测RNA样品浓度和纯度，分别读取A260和A280吸光度值，重复3次取平均值。根据制造商的说明书进行miRNA或mRNA的定量。使用的RT-qPCR引物如下：CCNJ正向序列：5'-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3'，反向序列：5'-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3'；GAPDH正向序列：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'和反向序列：5'-TGGT GAAGACGCCAGTGGA-3'。循环条件如下：在95℃下初始变性60 s，95℃下5秒，58℃下20 s，40个循环。

1.2.6 Western blot（蛋白免疫印迹法）检测蛋白表达水平 收集各组细胞，加入含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，放入-20℃冰箱过夜，离心30 min（12000 r/min），留取上清液。BCA法测出蛋白浓度，调整每组样本所需上样量相同，将各组样本加入蛋白凝胶内，90 V恒压电泳，200 mA恒流将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜。室温摇床，使用5%脱脂奶粉进行封闭2 h，使用TPBS洗涤5 min，重复3次。按1：1000稀释CCNJ一抗，摇床1 h后，4℃孵过夜，次日用HRP标记的山羊抗兔（二抗）孵育2 h。使用凝胶成像系统进行曝光，使用β-actin内参。获取图像后用Image J分析软件计算灰度值，从而计算蛋白表达量，每组实验独立重复3次。

1.3 统计学方法

应用SPSS 21.0软件分析实验数据，服从或近似服从正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验

MTT结果显示，上调HNE-1/DDP中miR-146a，细胞存活率较空白组、阴性对照组组降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），由此可知上调miR-146a可提高HNE-1/DDP细胞对DDP的敏感性，降低细胞耐药性(图1)。

图1 MTT检测细胞存活率统计图上调miR-146a使HNE-1/DDP细胞存活率降低*P＜0.05，**P＜0.01，与阴性对照组及空白组比较Fig.1 Statistical chart of cell survival rate detected by MTTUp-regulated miR-146a reduces cell survival rate of HNE-1/DDP*P＜0.05,**P＜0.01,compared with blank control group and negative control group

2.2 流式细胞仪检测

根据Annexin V-FITC/PI双染结果，mimics-miR-146a组细胞的凋亡率较其他两组升高，由此可知，上调miR-146a可使HNE-1/DDP细胞对DDP的敏感性提高，从而促进细胞发生凋亡(图2)。

图2 流式细胞仪检测结果,上调miR-146a使HNE-1/DDP细胞凋亡率升高Mock+DDP：空白组NC+DDP：阴性对照组miR-146a+DDP：mimics-miR-146a组Fig.2 Detection result by flow cytometry,up-regulated miR-146a to increase apoptosis rate of HNE-1/DDPMock+DDP:blank control group；NC+DDP:negative control group；miR-146a+DDP：mimics-miR-146a group

2.3 RT-qPCR检测

由RT-qPCR结果可知，mimics-miR-146a组中CCNJ的mRNA的相对表达水平较阴性对照组和空白对照组降低，差异具有统计学意义，P＜0.05，如图3。

2.4 Western blot检测

Western blot检测结果显示，mimics-miR-146a组的p53、caspase3以及CCNJ蛋白的相对表达量较阴性对照组、空白对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），当CCNJ下降时，其使得下游耐药性相关蛋白如P-gp，MRP1含量降低，继而提高细胞对DDP的敏感性(图4)。

3 讨论

鼻咽癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤，发病部位隐蔽，病情发展迅速，预后差，复发率高，确诊后以放化疗为主。但放化疗副作用较大，故如何以最小的剂量获得最大的疗效成为当代治疗恶性肿瘤的主旨。miRNA家族是一种单链非编码小RNA的超家族，以其丰富的作用成为近年来研究的热点。大量研究证明，不同miRNA或可抑制肿瘤或可诱发肿瘤，且对肿瘤细胞的侵袭、增殖、迁移能力都有调控作用[14～17]；其在降低非小细胞肺癌等肿瘤耐药性方面有突出疗效[5]，还具有抑制乳腺癌和胰腺癌的侵袭和迁移能力的潜力。miR-146a还可促进动脉粥样硬化形成[18,19]。

图3 RT-qPCR检测结果统计图上调miR-146a使HNE-1/DDP细胞中CCNJmRNA表达降低*P＜0.05，与阴性对照组及空白组比较Fig.3 Statistical chart of detection result by RT-qPCRUp-regulated miR-146a reduces the expression of CCNJmRNA in HNE-1/DDP*P＜0.05,compared with negative control group and blank control group

CCNJ是细胞周期蛋白家族成员，通过形成CDK2/CCNJ复合物来控制参与肿瘤发生和胚胎发生的细胞有丝分裂[20,21]。在体外，抑制CCNJ蛋白表达可以修复乳腺癌和胃癌细胞的增殖能力[22]。研究表明，CCNJ蛋白可能是肝癌（HCC）和急性白血病（ALM）的新型预后标志物[23,24]。

本组曾研究miR-146a可降低HNE-1/DDP的耐药性，提高对DDP的敏感性，本次MTT实验证实上调miR-146a后细胞增殖率降低；Annexin V-FITC/PI双染结果显示加入相同浓度的DDP，细胞凋亡率升高；通过RT-qPCR检测到mimics-miR-146a组CCNJmRNA较其他两组降低；Western blot显示CCNJ蛋白较其他两组降低，其下游信号分子P-gp、MRP1相对表达量降低，证明CCNJ可能是其重要靶点之一。因此推断，上调miR-146a可提高HNE-1/DDP细胞对DDP的敏感性，作用机制可能是上调miR-146a能够抑制细胞周期素相关蛋白CCNJ的表达进而调控下游信号分子MRP1、P-gp，从而降低细胞耐药性。

图4 Western blot检测结果上调miR-146a使HNE-1/DDP细胞中CCNJ、P-gp、MRP1蛋白含量降低A：蛋白印迹实验结果B：MRP1蛋白相对表达量统计图C：P-gp蛋白相对表达量统计图D：CCNJ蛋白相对表达量统计图Mock：空白组NC：阴性对照组miR-146a：mimics-miR-146a组*P＜0.05，**P＜0.01，与相应的阴性对照组及空白组比较Fig.4 Western blot detection resultUp-regulated miR-146a reduces the protein level of CCNJ、P-gp、MRP1 in HNE-1/DDPA：Result of Western blot；B：Statistical chart of protein relative expression level of MRP1；C：Statistical chart of protein relative expression level of P-gp；D：Statistical chart of protein relative expression level of CCNJ；Mock：blank control group；NC：negative control group miR-146a：mimics-miR-146agroup*P＜0.05,**P＜0.01,compared with negative control group and blank control group

本实验表明上调miR-146a可提高HNE-1/DDP细胞对DDP的敏感性，减少常规化疗药物产生耐药性的弊端，为鼻咽癌的临床治疗提供了新思路，为广大化疗效果不明显的患者提供了希望，但其详细机制尚需反复验证，并需要进行活体实验以确定在体内复杂环境中miR-146a与DD联用对鼻咽癌的治疗效果。