乳腺癌超声弹性成像与TLR9、Her-2和ER的相关性

牡丹江医学院附属红旗医院 超声科，黑龙江 牡丹江 157011

引言

乳腺癌被视作现代女性第一疾病，据统计，至2008年，世界范围内乳腺癌占女性癌症新发病例的23%，女性癌症死亡病例的14%，已然成为现代女性健康和幸福生活的主要破坏者[1-2]。2005—2013年间我国女性乳腺癌发病率和死亡率城市均比农村高，然而农村女性乳腺癌发病率和死亡率具有更加明显的上升趋势[3]。因此对于乳腺癌患者而言，早期准确的诊断显得尤为重要。乳腺超声检查是乳腺癌筛查的常用影像技术，其优势为价格便宜而且无创，患者顺应性高。超声弹性成像是近年来发展的新的影像技术，可参照病灶硬度的不同确定患者乳腺肿瘤性质，所获得的信息可作为普通超声的重要补充。但是由于早期乳腺癌病灶不大，触诊不易触及，声像学特征不典型等特征，故而存在部分患者出现漏诊、误诊现象[4-5]。有研究证实，Toll样受体9（Toll-Like Receptor 9，TLR9）在乳腺癌细胞中呈高表达，并且与乳腺癌细胞的迁移侵袭有关[6-7]。人表皮生长因子受体-2（Human epidemic growth factor receptor-2，Her-2）和雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）是评价乳腺癌预后及指导临床治疗的重要指标[8-11]。因此，本研究探讨乳腺癌超声弹性成像与TLR9、Her-2和ER表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集牡丹江医学院附属红旗医院门诊或者住院于2017年1月至2018年12月收治的乳腺癌患者。纳入标准：① 经超声发现乳腺肿块者；② 经超声引导下穿刺活检或手术切除者；③ 病理诊断明确者[12]；④ 术前未曾放疗，化疗或者内分泌治疗者。排除标准：① 临床资料不全或者缺失者；② 精神病患者或者不能配合检查者；③ 由其他部位肿瘤转移至乳腺部位者；④ 哺乳期者；⑤ 其他不符合本研究拟纳入标准者。最终共纳入患者176例：性别均为女性；年龄29～75岁，平均（46.96±7.83）岁；身体质量指数（Body Mass Index，BMI）21.2～26.7 kg/m2，平均（22.87±3.98）kg/m2。所有参与本研究的患者（或家属）均知悉同意本研究，并签署书面同意书。本研究经牡丹江医学院附属红旗医院伦理委员会批准并受其监督。

1.2 方法

1.2.1 超声检查

患者取仰卧位，双手自然上举，充分暴露乳房和腋窝。嘱患者平静呼吸。应用日本日立公司的EUP-L54M型彩色超声诊断仪，探头频率6.0～13.0 MHz。先对双侧乳房按照乳头-乳晕-外上-外下-内下-内上象限的顺序进行二维灰阶超声检查，记录其特点，并根据二维特征判断良恶性肿块。继而切换至弹性成像模式，先将设备调整到弹性成像感兴趣区，手持探头垂直于淋巴结作连续手动压缩，垂直病灶方向对组织施加一定压力，压力指标的数字控制在3～4级，双幅实时显示功能，同时观察二维图像与弹性图像，当病肿块积较大时对肿块分区域观察。采用5分法对肿块硬度进行评分[13]：肿块整体或大部分显示为绿色=1分；肿块范围内显示为绿色和蓝色所占比例相近，以绿色为主=2分；肿块显示中心为蓝色，周边为绿色=3分；病灶整体为蓝色或伴有少许绿色=4分；肿块和周边组织均显示为蓝色，内部伴有或不伴有绿色=5分。1～3分诊断为良性，4～5分诊断为恶性。

1.2.2 TLR9、Her-2和ER表达检测

收集患者标本，4%的多聚甲醛固定，常规脱水后用石蜡包埋，厚度4 μm连续切片，按照试剂盒（上海彩佑实业有限公司）的说明完成免疫组织化学染色。日本OLYMPUS CX31显微镜下选取5个高倍镜视野（×200）计数TLR9、Her-2和ER阳性细胞所占的百分比，并进 行 评 分：5%=0分；6%～25%=1分；26%～50%=2分；51%～75%=3分；>75%为4分。Image Pro-Plus 6.0软件测量阳性细胞染色强度，并进行评分：无色=0分；淡黄色=1分；黄色=2分；棕黄色=3分。最后将两项相乘由此将结果分为：0～2分=“-”；3～4分=“+”；5～8分=“++”；9～12=“+++”4个等级。根据文献资料，≥3分可诊断为恶性[14]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件包对数据进行分析，计数资料采用例数或百分比表示。采用Spearman相关分析法进行相关性分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理结果

176例乳腺癌患者病理类型包括浸润性导管癌、黏液腺癌、浸润性小叶癌、原位癌、导管内癌、恶性淋巴瘤、血管肉瘤和其他等8类，其对应的患者例数（占比）分别为 92（52.27%）、11（6.25%）、23（13.07%）、13（7.39%）、18（10.23%）、9（5.11%）、7（3.98%）和3（1.70%）。

2.2 超声征象与TLR9、Her-2和ER阳性表达的相关性

TLR9的阳性表达与肿瘤边缘，内部回声相关性不显著（P＞0.05），TLR9的阳性表达与肿瘤大小、形状、微小钙化、血供、淋巴转移、弹性评分显著相关（P＜0.05）；Her-2的阳性表达与肿瘤大小，内部回声、弹性评分相关性不显著（P＞0.05），Her-2的阳性表达与肿瘤形状、边缘、微小钙化、血供、淋巴转移显著相关（P＜0.05）；ER的阳性表达与肿瘤大小，内部回声、微小钙化、血供、弹性评分相关性不显著（P＞0.05），ER的阳性表达与肿瘤形状、边缘、淋巴转移显著相关（P＜0.05），见表1。

表1 超声征象与TLR9、Her-2和ER阳性表达的相关性

2.3 超声弹性成像与TLR9、Her-2和ER阳性表达

图1为某56岁女性乳腺癌患者超声弹性成像的结果，肿块其下方被蓝色区域覆盖，周边绿色超声弹性评分5分，病理结果为浸润性导管癌。图2为与图1为同一患者的TLR9、Her-2和ER阳性表达结果：TLR9阳性表达（+++），见图2a，Her-2阳性表达（+++），见图2b，ER阳性表达 （+++），见图2c。

图1 超声弹性成像

图2 免疫组织化学检测结果

3 讨论

超声弹性成像是在常规二维超声基础上发展而来的一种检测技术，可以将病变的硬度以彩色色阶实时呈现，通过弹性评分来判断肿瘤的良恶性，在一定程度上弥补了常规二维超声的不足，因乳腺癌组织较良性乳腺病变的质地硬、弹性差，故也具有良好的诊断效能[15]。超声弹性成像能够反映被测物体的硬度，组织异常病理状态与组织的硬度或弹性改变相关[16]。超声弹性成像评分差异的不同即硬度的不同与肿瘤的恶性程度呈正相关，也就是评分越高，硬度越大，恶性程度越高，反之亦然。

TLR9是Toll样受体（Toll-Like Receptors，TLRs）家族中的一员，在配体的作用下，抗菌肽37通过调节其在核内的摄取进而使乳腺癌细胞的侵袭性增强[17]。另外，当TLR9激活后亦加强了乳腺癌细胞的迁移[18]。Her-2和ER是临床诊断乳腺癌应用较多的生物学指标。Her-2被认为是一种有效标记恶性肿瘤侵袭性行为的生物学指标，其基因表达的具有酪氨酸激酶活性的蛋白在细胞信号的转导中起着重要作用，主要参与了调节细胞的生长及分化，促进细胞的分裂及增殖，其中最重要的是通过增加血管内皮生长因子的产生而导致的新生血管生成[19]。Her-2的表达与乳腺癌的发生发展密切相关，可为恶性程度和转移提供参考，并且可作为乳腺癌诊断和评估的独立危险因素[20]。ER是核受体，其主要配体是17-β-雌二醇，作为配体依赖性转录因子来调节涉及乳腺癌细胞增殖、存活、侵袭和肿瘤新生血管形成的下游基因[21]。ER的阳性表达被认为是乳腺癌分化和评估预后的理想标志物[22]。

增殖是肿瘤最基本的特性之一，肿块直径>2 cm说明肿块体积较大，临床分期较晚，恶性程度高。本研究表明，肿块较大患者TLR9和ER阳性表达较高，此结果与文献报道结果相一致[23-24]。然而肿块的大小可能与诊断发现的时间早晚有关，故仅以肿块的大小不能直接判断TLR9和ER阳性表达。肿块形态是否规则被视为判断乳腺病变良、恶性的常规指标。肿块外形不规则TLR9、ER阳性率高，外形规则组TLR9、ER阴性率高，即TLR9、ER阳性者多表现为外形不规则，TLR9、ER阴性者多表现为外形规则[25-26]；外形不规则Her-2阳性率高，即高恶性肿块外形多呈不规则改变，预示肿块侵袭性强，两者生物学行为一致[27]。本研究中，外形不规则患者TLR9、Her-2、ER阳性表达显著高于规则患者。边缘“毛刺征”是由乳腺癌细胞侵入周围组织引起的星状畸变，它的存在是描述恶性肿瘤的重要线索，同时也是乳腺癌的象征性表现，即有边缘“毛刺征”结节的Her-2、ER阳性率大于无边缘“毛刺征”者，“毛刺征”与Her-2、ER阳性表达有关[28-30]。本研究肿块“毛刺征”组中，Her-2、ER阳性表达高，两者存在潜在联系，生物学行为一致。乳腺癌的钙化通常是微小钙化，主要是由组织引起的肿瘤的变性，坏死和钙盐的沉淀[31]。在本研究中，TLR9、Her-2阳性表达与微小钙化显著相关，表明肿瘤恶性程度增加，随着钙化，肿瘤会侵袭而且患者的预后很差。肿瘤血液供应，作为一种肿瘤形态变化的重要标志，对于肿瘤的发展很重要，所以检测血液供应有利于判断肿瘤侵袭和预后。在本研究中，TLR9、Her-2的阳性表达与血供相关。淋巴结转移在超声弹性成像表现为低回声，如若患者发生转移提示肿瘤恶性增强[32]。研究表明，乳腺癌转移灶中TLR9、Her-2、ER呈高表达[33-35]。在本研究中，TLR9、Her-2、ER阳性表达与淋巴转移呈正相关。淋巴结转移时，参考TLR9、Her-2、ER高表达提示肿瘤侵袭性与转移性强。通常认为，乳腺内组织的弹性系数与组织的硬度成正比，浸润性导管癌硬度较高，本研究中大部分为浸润性导管癌，占52.27%。TLR9表达越高，肿瘤细胞增殖率越高，临床分期高，易出现侵袭，与周围组织粘连致肿块弹性减小、硬度增加[36]。本研究中，弹性成像高评分组TLR9具高表达率。肿块质地越硬，肿瘤恶性程度高，这与TLR9高表达提示肿瘤侵袭性高度吻合[17]。

综上所述，乳腺癌超声特征与TLR9、Her-2、ER阳性表达有一定的相关性，联合检测可提高乳腺癌诊断的准确性。本研究的局限之处在于：样本量较少、检测时间点单一、无连续多时间观察。在本研究的后续研究中，将会增加样本量及多时间点检测，进一步确保结果的准确性。