初治系统性红斑狼疮患者外周血中NK细胞的变化及临床意义①

邢 雪 袁启航 叶小康 李 霞 陆智敏

(大连医科大学基础医学院免疫学教研室，大连 116044)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以多种淋巴细胞异常活化和多器官受累为特征的自身免疫性疾病[1]。免疫学家一直致力于适应性免疫细胞(包括T细胞和B细胞)在SLE发病中的机制研究，关于天然免疫核心细胞自然杀伤细胞(natural killer，NK)的研究仍较少[2]。NK细胞占外周血淋巴细胞总数的5%～20%，在抗感染免疫、肿瘤免疫及免疫调节中发挥重要作用，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁[3-4]。目前多数研究提示NK细胞在SLE中数量异常，但机制尚不清楚[4-6]。且糖皮质激素及免疫抑制剂本身也会影响NK细胞数量及功能，为了进一步探究NK细胞在SLE中的变化及作用，本文将分析初治SLE患者(未使用糖皮质激素及免疫抑制剂)外周血中NK细胞的变化及临床意义。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1病例选择 该研究为横断面研究。选取2018年1月至2018年12月于南通大学附属医院就诊的初治SLE患者(未使用糖皮质激素及免疫抑制剂)42例，均符合美国风湿病学会(ACR)1997年修订的SLE分类诊断标准，排除感染、肿瘤及其他自身免疫病[7]。疾病活动评分采用系统性红斑狼疮疾病活动评分(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[8]。其中女性38例，男性4例，平均年龄(37.1±14.1)岁；另选正常对照组25例，其中女性22例，男性3例，平均年龄(32.3±8.9)岁，均来自南通大学附属医院体检中心的健康人群，无风湿病史和风湿病家族史。各组年龄、性别差异比较均无统计学意义。狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)定义为24 h尿蛋白大于0.5 g或尿沉渣(WBC>5/HP or RBC >5/HP)或肾活检证实。42例SLE患者LN组18例，无LN组24例。本研究取得所有受试者的知情同意并获得南通大学附属医院伦理委员会批准(批件号：2016-041)。

1.1.2主要试剂与仪器 FITC-conjugated anti-CD3及 PE-conjugated anti-CD56 购于美国BD公司；鼠抗人 FITC-and PE-conjugated IgG1 作为同型对照；人淋巴细胞分离液购于中国医学科学院生物工程研究所。FACSCalibur型流式细胞仪购于美国BD公司；流式分析软件为FCS ExpressV3(De Novo Software，Canada)。

1.2方法

1.2.1标本采集 采集肝素抗凝外周血4 ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，800 g离心30 min，计数。

1.2.2NK细胞数量的检测 PBMC经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，调整细胞浓度为2×106个/ml，加入FITC-CD3、PE-CD56，对照管加相应的同型对照，常温避光20 min，1 ml PBS洗涤。分析CD3-CD56+细胞占百分率并计算绝对数。

1.2.3临床指标的检测 白细胞(white blood cell，WBC)、血红蛋白(blood hemoglobin，Hb)、血小板(blood platelet，PLT)、血沉(erythrocyte sedimentation rate ,ESR)、C反应蛋白(serum levels of C-reactive protein,CRP)、补体C3、补体C4、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、抗dsDNA抗体、抗核抗体(ANA)、24 h尿蛋白定量常规检测。

2 结果

2.1初治SLE患者临床资料 42例初治SLE患者基本临床资料见表1。平均年龄为(37.1±14.1)岁，女性38例，男性4例，病程(36.1±57.9)个月。SLEDAI评分为(10.52±4.96)分。

表1 初治SLE患者临床资料

2.2初治SLE患者外周血中NK细胞变化 初治SLE患者外周血中NK细胞占淋巴细胞百分率为(5.8±3.8)%，低于正常对照组的(13.4±4.9)%(P<0.01)。与正常对照组相比，SLE患者外周血中NK细胞绝对数显著下降[(267.9±111.9)个/μl vs(60.3±46.2)个/μl](P<0.01)。初治SLE患者SLEDAI评分为10.52±4.96。根据SLEDAI评分分为不活动5例(0～4分)，轻度活动12例(5～10分)，中重度活动25例(大于10分)。与不活动组相比，中重度活动组NK细胞绝对数显著下降[(49±34)个/μl vs(108±51)个/μl](P<0.01)。见图1。

图1 初治SLE患者外周血中NK细胞变化

2.3SLE患者外周血中NK细胞数量与临床指标的相关性分析 NK细胞绝对数与SLEDAI评分呈负相关(r=-0.365，P=0.018)。SLE患者外周血PLT计数为(188.4±92.0)×109个/L，补体C3(0.49±0.24)g/L。PLT(r=0.343，P=0.026)及补体C3(r=0.445，P=0.003)均与NK细胞绝对数呈正相关。抗dsDNA抗体滴度与NK细胞绝对数有负相关趋势(r=-0.263，P=0.093)，见图2。NK细胞数量与血清补体C4、ESR、CRP、免疫球蛋白均无显著相关性。

图2 初治SLE患者外周血中NK细胞绝对数与疾病活动度相关性分析

2.4LN组NK细胞数量显著减少 LN组外周血NK细胞绝对数明显低于无LN组(43.8±48.9 vs 72.6±40.8，P<0.05)，差异有统计学意义。两组NK百分率无统计学差异(4.9±3.7% vs 6.4±3.9%，P=0.238)。见图3。

图3 LN患者外周血中NK细胞变化

3 讨论

SLE是自身免疫病的原型疾病，好发于育龄期女性，全身各脏器均可受累；以自身DNA及RNA大量释放及淋巴细胞活化产生多种自身抗体为特征[1]。近年来，早期发现、规范治疗使SLE患者生存期延长，而感染成为SLE最常见的死亡原因[9-10]。与获得性免疫缺陷病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)患者类似，SLE患者也是各种机会性感染(尤其病毒感染)的好发人群。此外，感染也是SLE患者疾病复发的主要因素之一。目前较公认的观点是药物使用及自身免疫功能异常均参与了SLE患者易感染及感染不易控制，但其机制尚未完全明确。

NK细胞是经典的固有免疫细胞，能迅速杀伤靶细胞(如病毒感染的宿主细胞)，且无MHC限制性，在机体抗感染免疫应答的早期发挥重要作用。同时NK细胞还具有强大的细胞因子分泌功能，不仅调节固有免疫应答，而且参与调节获得性免疫应答，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁[3-4]。

目前多数研究均提示SLE患者外周血中NK细胞显著减少[4-6,11-13]。由于糖皮质激素、免疫抑制剂会影响NK细胞的数量，本研究纳入初发SLE患者(未使用糖皮质激素及免疫抑制剂)，同样证实NK细胞绝对数及百分率均明显下降，其中以绝对数显著下降，不到正常人的四分之一，提示NK细胞在狼疮疾病发生发展中发挥重要作用。

NK细胞表面活化性受体和抑制性受体处于动态平衡，对维持该细胞的功能发挥重要作用。关于各型受体在SLE患者外周血变化的研究尚存在争议。HUANG等[13]发现抑制性受体CD158b 分子及活化受体CD16、CD226在SLE患者NK细胞上的表达均下降，其他抑制剂受体(NKG2A、CD94 和 CD85j)及活化性受体(NKG2D、NKp46 和 CD69)没有差异。在部分活动期患者中药物治疗可有效恢复 CD226+NK细胞比例。HERVIER等[12]研究证实SLE患者外周血中NK细胞的细胞毒作用下降，分泌IFN-γ增多，其表面CD69和NKG2A表达增多，CD16和KIR(the killer cell immunoglobulin-like receptor)KIR2DL1/KIR2DS1表达减少。一项来自台湾研究证实SLE患者体内NK细胞对IL-15反应减低，杀伤能力下降[14]。BANCHEREAU等[15]对于SLE患者全血指纹测序研究提示，SLE患者体内NK细胞的细胞毒性作用显著减少。既往研究证实与正常组相比，SLE患者NK细胞表达穿孔素减少，表达颗粒酶B平均荧光强度增加，分泌IFN-γ增多；IL-15可以增强NK细胞IFN-γ/TNF-α分泌、穿孔素/颗粒酶以及CD107a脱颗粒表达[6]。以上关于NK细胞表型的研究尚有争议，其在SLE患者中表型的变化需要更大样本量的研究。

NK细胞的功能状态是各型表面分子综合作用的结果，不能单纯的用活化和抑制来反映。不同药物的治疗及人群的选择可能导致结果的差异，提示无糖皮质激素及免疫抑制剂治疗患者的结果更能反映SLE患者体内NK细胞的真实状态。研究证实SLE患者体内IFN-a导致NK细胞活化后凋亡增加，从而导致数量减少。该研究团队同时发现CD226+NK细胞浸润至狼疮鼠的肾脏，并通过分泌细胞毒性颗粒和细胞因子发挥致病作用[13,16]。且LN患者肾脏组织病理中NK细胞表面活化受体NKG2D的配体MICA显著增多[16]。本研究证实LN患者外周血NK细胞显著低于无LN的SLE患者，推测NK可能通过趋化至局部发挥重要致病作用，进而导致外周血中数量的下降，具体机制有待进一步研究。

SEGERBERG等[17]研究提示抗KIR阳性SLE患者体内的IgG在体外可降低NK细胞对K562细胞的杀伤能力。近期研究发现部分活动性SLE患者外周血中存在抗CD94/NKG2A抗体和抗 CD94/NKG2C 抗体，该抗体可减少NK细胞某些亚群的数量及功能，在SLE疾病中发挥重要作用[18]。HANAOKA等[19]研究证实SLE患者体内NK细胞中的NKG2D可通过Caspase通路导致CD3ζ 信号传导异常，在自身免疫病中发挥重要作用。哈佛大学研究团队证实CD3ζ水平与NK细胞毒性作用相关，且NK细胞CD3ζ表达下调导致SLE患者NK细胞炎症表型[20]。

此外有研究证实SLE患者外周血中NK细胞表达CD80、CD86及HLA-DR增高，可以调节DC细胞功能，进而在SLE疾病中发挥调节性功能。同时NK细胞可通过杀伤 iDCs抑制适应性免疫应答，并影响T细胞功能，推测其数量的减少可能导致适应性免疫异常加剧，双链DNA抗体增加，患者疾病活动度增加，具体机制还有待进一步研究[21]。

本研究证实NK细胞减少与疾病活动评分、补体C3及抗dsDNA抗体显著相关，提示NK细胞功能异常参与狼疮疾病发生发展有关。补体可以通过DC细胞调节NK细胞的功能，推测低补体血症时，NK细胞接受DC细胞的初始刺激异常，可能导致细胞数量及功能异常，具体机制还有待进一步研究[22]。且NK细胞为一线的抗感染细胞，其数量显著减少可能与SLE患者容易发生机会性感染相关，推测调节NK细胞的数量及功能对控制狼疮机会性感染及改善SLE预后有重要意义。

SLE中NK细胞存在数量及功能的异常，其在固有免疫及适应性免疫之间所起作用及机制充满未知。对NK细胞在SLE发病机制中进行更深入研究可能会开创SLE新的治疗策略。