SATB1通过PI3K/Akt信号通路在哌立福新对胃癌失巢凋亡抵抗细胞作用机制中的研究①

秦玉萍 高迎新 马熙萌 杜 瑶 王 新 禹 莉

(蚌埠医学院肿瘤基础研究与临床检验诊断重点实验室，蚌埠 233030)

流行病学资料显示，胃癌是危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一[1-2]。我国胃癌发病率一直呈上升和年轻化趋势，死亡率高，预后差，确诊后5年生存率仅为20%～30%[3]。胃癌恶性侵袭和转移是造成其预后不良的主要原因。在以手术为主，以放化疗为辅的传统方式治疗胃癌预后效果不佳的情况下，明确胃癌发病机制，控制胃癌的侵袭及转移十分重要。

失巢凋亡能使正常细胞在增殖、分化和凋亡过程中保持动态平衡，而失巢凋亡抵抗是恶性细胞的一个特征，在肿瘤转移中起重要作用[4]。研究表明，在肿瘤细胞对凋亡抵抗的过程中，涉及多种信号转导。如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路不仅调节肿瘤细胞的增殖与活化，还影响肿瘤细胞的侵袭、迁移、细胞外基质的降解以及肿瘤血管生成等[5-6]。最近研究表明PI3K/Akt信号通路与胃癌发生、发展密切相关[7]。这一信号通路的激活可能是肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的主要机制之一[6]。哌立福新是一种合成的烷基磷脂化合物，是Akt的特异性抑制剂[8-9]。在复发或者难治性多发性骨髓瘤中已行Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，并取得较好效果，准备进入第Ⅲ期临床试验，哌立福新治疗侵袭性结直肠癌、复发性胶质母细胞瘤也已进入Ⅱ期临床试验阶段[10-13]。因此哌立福新在研究PI3K/Akt信号通路在肿瘤中的作用有重要意义。

特异AT序列结合蛋白1(special AT-rich sequence-binding protein 1，SATB1)通过影响染色质的结构组织，与多种转录共激活子和共同抑制因子的相互作用，影响肿瘤生物学行为。并且与肿瘤生长、转移以及临床病理特征如TNM分期增加、肿瘤分化减少和总生存期缩短相关，因此SATB1的表达被确定为各种癌症的独立预后标志物[14]。此外，基因敲除或异位过度表达策略已证实SATB1可影响细胞增殖、细胞周期、凋亡、细胞形态/细胞极性、EMT、多药耐药性以及肿瘤的形成、生长、侵袭和转移[15]。

既然PI3K/Akt信号转导通路的活化及SATB1基因表达的上调在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移中扮演着重要的角色，而失巢凋亡抵抗又与肿瘤细胞的存活和转移密切相关。那么，胃癌细胞的存活和转移是否也与上述分子事件有关联？发生了失巢凋亡抵抗的胃癌细胞，其生物学行为特性是否随之发生改变？抑制PI3K/Akt信号传导通路及干扰SATB1基因的表达对胃癌细胞抗失巢凋亡能力又有什么影响？本研究建立了胃癌AGS失巢凋亡抵抗细胞模型，检测哌立福新对其PI3K/Akt信号通路活性及细胞生物学行为的影响，从分子生物学水平检测靶向抑制剂对胃癌失巢凋亡抵抗细胞关键信号分子的作用，从而为抗肿瘤靶向药物的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 人胃癌细胞系AGS购自上海细胞库；RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物科技公司；胰酶细胞消化液、二喹啉甲酸BCA蛋白浓度测定试剂盒、结晶紫染色液、RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司；基质胶(Matrigel)、Transwell小室购自美国Corning公司；Poly-HEMA购自美国Sigma公司；哌立福新购自上海一基实业有限公司；Akt、p-Akt、PTEN、MMP-2、SATB1、Vimentin、Slug、E-cadherin、β-actin购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG购自美国Abclonal公司；PVDF膜、ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人胃癌细胞系AGS培养于含10%FBS和1%青霉素/链霉素新鲜的RPMI1640细胞培养基中，在37℃和5%CO2的细胞培养箱中培养至对数期。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2超低黏附培养板制备 将1.2 g poly-HEMA溶解于无水乙醇中，60℃加热振荡过夜，制备成120 mg/ml Poly-HEMA贮存溶液，临用前，用无水乙醇按1∶9 稀释成12 mg/ml的工作液。6孔板每孔加入1 ml工作液铺板，待其干燥充分凝固后，追加0.5 ml溶液重新包被，制备成超低黏附培养板。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，紫外线消毒，4℃冰箱保存备用。使用前紫外线再次照射1 h。

1.2.3胃癌细胞失巢凋亡培养 用0.25%胰蛋白酶消化收集对数生长期AGS细胞，制成单细胞悬液，平分到Poly-HEMA包被处理的6孔培养板中。将6孔板置于摇床上，37℃，5% CO2环境中孵育。隔日换液，换液方法：将细胞用吸管移入离心管中，500 r/min，离心5 min，弃上清，加新鲜RPMI1640培养基重悬，将细胞悬液加入6孔板中继续培养。以上方法悬浮培养AGS细胞10 d，模拟胃癌细胞脱离周围细胞或细胞外基质的状态。收集到15 ml 的离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入新鲜培养基重悬，将细胞悬液置于普通培养瓶中重贴壁培养3 d，待长成单层，即可诱导获得胃癌失巢凋亡抵抗AGS细胞，而用于诱导的细胞称为胃癌亲本细胞。胃癌失巢凋亡抵抗细胞重贴壁培养后换液、传代方法与亲本AGS细胞相同。为保证诱导获得的胃癌失巢凋亡抵抗细胞在生物学特性方面的稳定性，每项实验开始前2周就开始诱导，获得胃癌失巢凋亡抵抗细胞后就进行相关实验，避免胃癌失巢凋亡抵抗细胞多次传代。

1.2.4MTT法检测细胞增殖能力 在96孔板中以4×103个/孔接种200 μl胃癌失巢凋亡抵抗AGS细胞悬液。37℃，5%CO2浓度培养24 h，分别加入0、1、2、3、4、5 μmol/L哌立福新作用24 h，空白对照组(只添加培养基)。用20 μl MTT(5 mg/ml)孵育 4 h，丢弃培养基，每孔加入200 μl二甲基亚砜，避光振荡10 min，待蓝紫色结晶充分溶解后，酶标仪读取吸光度值。每组实验重复3次，每次设5个平行孔。

1.2.5细胞克隆形成实验 将胃癌亲本AGS细胞和失巢凋亡抵抗AGS 细胞以1 000个/孔接种于6孔板中，培养箱中培养14 d，隔日观察细胞生长情况，定时换液。出现肉眼可见的细胞时，弃去培养液，PBS洗3遍，4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min。结晶紫染20 min。倒置显微镜下观察细胞集落，计克隆形成数目。

1.2.6Annexin-V/PI染色法检测细胞凋亡 收集细胞，用冷PBS洗涤2次，用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒中的结合缓冲液300 μl重新悬浮细胞，静置5～10 min。然后与Annexin V-FITC室温下避光孵育15 min，与PI在4℃避光静置 10 min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。每组样本各设 3 个复孔。

1.2.7Wright-Giemsa染色 失巢凋亡抵抗AGS细胞接种于6孔板中孵育 24 h，然后用哌立福新处理24 h，取出盖玻片晾干。Wright-Giemsa染色法对细胞进行染色，光学显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.2.8细胞划痕实验 将失巢凋亡抵抗AGS细胞铺于6孔板中培养 24 h 后，用移液枪10 μl枪头在培养板中划直线，PBS洗涤3遍，将滑落的细胞洗掉，处理细胞后继续培养20 h，PBS洗涤去除悬浮细胞，分别于0 h和20 h在10倍倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.9Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭 侵袭实验与迁移实验方法类似，区别仅是侵袭实验前用Matrigel基质胶包被Transwell小室上层。用无血清培养液重悬细胞，调整细胞密度为3×105个/ml，取100 μl接种于上室，下室加入含10% FBS的完全培养基600 μl，然后将Transwell小室放入培养箱中培养24 h后取出小室，棉签擦去上层未穿过小室膜的细胞，4%多聚甲醛溶液固定，结晶紫染色，PBS清洗2～3次，风干后置于倒置显微镜下拍照采图，随机选取5个视野，计数穿过小室膜的细胞数量，反映细胞迁移和侵袭能力。

1.2.10qRT-PCR检测 按说明书用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，用PrimeScript RT试剂盒进行反转录反应合成cDNA。qRT-PCR采用SYBR Primix EX TaqTMⅡ试剂盒检测，反应体系和扩增条件参考说明书进行操作。靶基因和β-actin的引物序列见表1。用2-ΔΔCt计算相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.11Western blot检测蛋白表达 收集各组细胞，用含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，提取总蛋白，使用BCA 法进行蛋白定量，10% SDS-PAGE 凝胶电泳使蛋白分离，将蛋白转至 PVDF膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜 3遍，每次洗涤10 min，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜 3遍，用ECL化学发光试剂盒、Bio-Rad公司凝胶成像仪显影，Imagelab图像分析软件测定条带灰度值，β-actin为内参，分析蛋白质的相对表达量。

2 结果

2.1胃癌失巢凋亡抵抗细胞模型的建立 在倒置相差显微镜下观察到，贴壁培养的人胃癌AGS细胞接种入培养板时，最初为单个分散细胞，呈小圆形。培养48 h～72 h后，细胞单层生长，排列整齐，胞体饱满呈多边形，大小均一(图1A)；当AGS细胞接种超低黏附培养板进行悬浮培养时，最初亦为呈小圆形的单个分散细胞(图1B)，其贴壁状态明显变差，生长缓慢，细胞边缘不整，随着时间推移，细胞逐渐聚集成簇，细胞簇在一段时间内不断增大，48 h 后可见细胞逐渐成团(图1C)，随后形成大而松散的珊瑚状细胞团(图1D)。悬浮培养10 d后，收集细胞接种于普通培养板中重贴壁培养，细胞形态，由原来亲本细胞贴壁生长时排列整齐、形状规则的多边形变成有较多突起、排列紊乱的不规则多角形(图1E)，但多次传代后，细胞形态逐渐恢复正常(图1F)。重贴壁细胞即为胃癌失巢凋亡抵抗AGS细胞。

图1 倒置相差显微镜下观察人胃癌AGS细胞在不同培养方式下的形态学变化

2.2失巢凋亡抵抗抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和迁移，上调转移相关基因 克隆形成实验结果显示，失巢凋亡抵抗AGS细胞较亲本细胞增殖能力增强(图2A)。Annexin V/PI染色显示细胞凋亡减少(图2B)。Transwell和细胞划痕实验结果显示，与亲代细胞相比，失巢凋亡抵抗AGS细胞侵袭和迁移能力增强(图2C～D)。Western blot结果显示，失巢凋亡抵抗AGS细胞中p-Akt、MMP-2和SATB1的表达上调，PTEN的表达较亲代细胞下调，而两者的Akt无显著差异(图2E)。

图2 失巢凋亡抵抗抑制胃癌AGS细胞凋亡，促进细胞增殖和迁移

2.3哌立福新抑制凋亡抵抗AGS细胞增殖，促进细胞凋亡 MTT法检测细胞活力，结果显示，当凋亡抵抗AGS细胞暴露于不同浓度的哌立福新时，细胞生长呈浓度依赖性抑制作用，细胞活力呈逐渐下降趋势(图3A)。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，与对照组相比，实验组的凋亡率随着浓度的增加而显著升高(P<0.05，图3B)。Wright-Giemsa染色结果显示：对照组AGS细胞胞浆清晰，颗粒少，细胞结构紧密，排列规则，悬浮细胞稀少，细胞增殖能力强。哌立福新组随着浓度的增加，细胞增殖减慢，培养基中漂浮细胞数量增多，细胞数量逐渐减少，黏附能力减弱。并且细胞逐渐变圆，碎片逐渐增多，细胞中的颗粒越来越多(图3C)。

图3 哌立福新抑制凋亡抵抗AGS细胞增殖，促进细胞凋亡

2.4哌立福新抑制凋亡抵抗AGS细胞侵袭、迁移能力 Transwell和细胞划痕实验表明：与0 μmol/L组相比，哌立福新组穿过小室膜的细胞数量减少(图4A)，划痕闭合率明显降低(图4B)(P<0.05或P<0.01)。哌立福新能明显抑制凋亡抵抗AGS细胞的侵袭和迁移能力。

图4 哌立福新抑制凋亡抵抗AGS细胞侵袭、迁移能力

2.5哌立福新对凋亡抵抗AGS细胞PIK3CA、AKT和PTEN基因表达的影响 qRT-PCR检测结果显示：与0 μmol/L组相比，凋亡抵抗 AGS细胞中PIK3CA mRNA、Akt mRNA的表达随着哌立福新浓度的增加而降低，PTEN mRNA表达在3 μmol/L哌立福新时显著增加(图5)。

图5 qRT-PCR基因表达的相对定量分析

2.6哌立福新对凋亡抵抗AGS细胞Akt、p-Akt、PTEN、MMP-2和STAB1蛋白表达的影响 Western blot检测凋亡抵抗AGS细胞中蛋白表达水平，结果显示，与对照组相比，p-Akt、MMP-2、STAB1蛋白表达显著降低，PTEN表达显著增加，Akt表达无统计学意义(图6)。

图6 哌立福新对失巢凋亡抵抗AGS细胞蛋白质表达的影响

2.7下调SATB1增强哌立福新介导的肿瘤抑制效应 为进一步研究SATB1在哌立福新介导的抗肿瘤效应中的作用，通过SATB1 siRNA转染凋亡抵抗AGS细胞，Western blot检测结果表明，转染后SATB1表达明显下调(图7A)，MTT数据分析表明，siRNA干扰SATB1表达能抑制凋亡抵抗AGS细胞的增殖，而且下调SATB1能增强哌立福新介导的细胞生长抑制(图7B)。流式细胞仪检测结果显示，下调SATB1能诱导凋亡抵抗AGS细胞的凋亡，而且能增强哌立福新诱导的细胞凋亡(图7C)。Transwell结果表明，下调SATB1能抑制凋亡抵抗AGS细胞的侵袭及迁移，而且能使哌立福新抑制细胞侵袭及迁移的作用增强(图8)。表明SATB1在哌立福新对凋亡抵抗AGS细胞的抗肿瘤活性中起着关键作用。

图7 下调SATB1增强哌立福新介导的肿瘤抑制效应

图8 下调SATB1使哌立福新抑制细胞侵袭及迁移的作用增强

3 讨论

细胞外基质是细胞生长和分化的基膜，当正常细胞脱离细胞粘附的细胞外基质，便失去与其他细胞或细胞外基质之间的联结，通常会引发细胞凋亡，又称为失巢凋亡，这是一种程序化细胞死亡形式，使调节细胞与基质之间正常细胞存活的信号被中断，失巢凋亡能使正常细胞在增殖、分化与凋亡中保持动态平衡，从而能确保细胞和组织内环境的稳态，其在机体正常发育、保持组织自身平衡、疾病的发病机制和肿瘤的转移中起着重要作用[16-17]。然而，许多肿瘤细胞由于获得失巢凋亡抵抗能力，可以在非锚定依赖条件下生存和生长，也就是说这些细胞在脱离原发肿瘤灶并通过血管或淋巴管侵入或迁移到远处转移部位时，可以在缺乏黏附的情况下存活[18-20]。肿瘤细胞具有抵抗失巢凋亡、侵袭和迁移能力强的特点，也是肿瘤发生转移的重要原因之一[21]。研究表明，胃癌的发生发展与失巢凋亡抵抗密切相关[22-25]。然而，确切的发病机制仍不清楚。

在以往的研究中，悬浮培养贴壁细胞通常用于建立失巢凋亡抵抗细胞模型[19-20]。课题组超低黏附培养板上悬浮培养胃癌AGS细胞一段时间后，再贴壁培养，存活下来的细胞被认为是凋亡抵抗细胞。结果显示，失巢凋亡抵抗AGS细胞比亲代细胞生长更快，凋亡率更低。Transwell实验和划痕实验均表明凋亡抵抗AGS细胞具有更强的侵袭和迁移能力。

近年来针对癌转移治疗的主要方法是分子靶向治疗。因此，识别新的靶分子对于提高胃癌治疗的临床疗效具有重要意义。许多信号转导途径及相关基因与肿瘤的抗失巢凋亡和转移过程有关。研究表明PI3K-Akt信号通路在上皮性卵巢癌、胃肠道癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌等多种肿瘤中都有明显的激活作用[26-29]。PI3K-Akt信号通路的激活可影响多种与肿瘤细胞生存和转移相关基因的表达，抑制多种刺激诱导的细胞凋亡，促进细胞生存和增殖，参与肿瘤血管生成、肿瘤侵袭和转移[30-31]。与以上报道一致，本次研究表明凋亡抵抗AGS细胞中PIK3CA、p-Akt、SATB1和MMP-2的表达增加。证实了PI3K/Akt通路的激活或过度表达可能促进胃癌细胞对失巢凋亡的抵抗。活化的Akt与AGS细胞对失巢凋亡的抵抗有关，并影响SATB1和MMP-2基因的表达，促进了AGS细胞的转移潜能。从而获得对失巢凋亡的抵抗会导致细胞外基质的重塑和PI3K/Akt通路成分的过度表达。因此，PI3K/Akt通路与AGS细胞的抗凋亡能力和胃癌的转移潜能有关。

有研究表明PTEN在多种肿瘤细胞的增殖和侵袭中起着重要的调节作用。PTEN的丢失在许多肿瘤中很常见。因此，PTEN被认为是一种癌症抑制因子[32]。PTEN是一种兼有脂质磷酸酶活性和蛋白质磷酸酶活性的双特异性磷酸酶。通过将磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)转化为磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)，对PI3K/Akt信号传导活性具有负调控作用，能拮抗PI3K活性[33]。研究表明PTEN在凋亡抵抗AGS细胞中的表达减少，而PIK3CA的表达增加，这可能与凋亡抵抗AGS细胞的增殖和侵袭有关。

哌立福新是一种新合成的烷基磷脂类化合物，它作为PI3K/Akt途径的抑制剂，具有抗肿瘤作用，Akt是哌立福新作用的重要细胞靶点[34]。Akt是一种调节细胞凋亡和存活的胞质信号转导蛋白。在生理状态下，Akt存在于低活性的细胞质中。当受到各种因素刺激时，Akt被磷酸化并被PI3K激活[35]。活化Akt可促进细胞存活、增殖、转移和血管生成。研究表明，Akt在许多人类肿瘤中被过度激活，如胃肠道肿瘤、胰腺癌和其他肿瘤组织。Akt在肿瘤细胞中的激活与肿瘤细胞的增殖和凋亡密切相关。Akt磷酸化可被特异性抑制剂哌立福新抑制[36-37]。因此，抑制信号通路已成为肿瘤治疗的靶点之一。

哌立福新在研究PI3K/Akt信号通路在肿瘤中的作用，具有重要意义。在多种肿瘤中，哌立福新在体内外实验中均显示出显著的增殖抑制活性，并准备进入Ⅲ期临床试验。研究表明，哌立福新和MEK/ERK抑制剂MEK-162或ABT-737 联合治疗能诱导肺癌细胞生长抑制和凋亡增加，体内实验能明显抑制肺癌的异种移植生长[38-39]。其在膀胱癌、肝癌、急性髓系白血病等肿瘤治疗中也发挥着重要作用[40-42]。本课题组研究表明，在凋亡抵抗AGS细胞中，哌立福新可能有助于抑制生长和诱导较高的凋亡率。此外，Transwell和划痕实验一致显示，哌立福新抑制了细胞的侵袭和迁移能力。凋亡抵抗细胞PIK3CA和Akt的mRNA表达降低，PTEN的表达增加。p-Akt、MMP-2和STAB1的蛋白表达随哌立福新浓度的增加而减少，PTEN的表达增加。哌立福新通过PI3K/Akt途径影响AGS细胞的侵袭和转移，具有抗癌作用，是治疗胃癌的一种潜在途径。

基因敲除或异位过度表达策略已证实SATB1可影响细胞增殖、细胞周期、凋亡、细胞形态/细胞极性、EMT和多药耐药性，以及肿瘤的形成、生长、侵袭和转移。研究发现，SATB1参与PI3K/Akt信号转导通路的调节，可以与PI3KC亚型基因的MARs序列结合，从而抑制PI3KC的转录[43]。Akt蛋白激酶使SATB1在丝氨酸47上磷酸化并保护SATB1防止其凋亡裂解[44]。本课题组研究表明，下调SATB1能增强哌立福新介导的细胞生长抑制，促进凋亡抵抗AGS细胞的凋亡，使哌立福新抑制细胞侵袭及迁移的作用增强，表明SATB1在哌立福新对凋亡抵抗AGS细胞的抗肿瘤活性中起着关键作用。

综上所述，哌立福新能不同程度地作用于凋亡抵抗AGS细胞，调节PI3K/Akt信号通路的关键信号分子，降低细胞增殖率，增加细胞凋亡率。哌立福新抑制细胞侵袭和迁移能力。然而，本研究的一个局限性是，仅使用AGS细胞株可能不能反映所有胃癌。使用其他细胞系的研究可能是必要的，以增加研究的概括性。