藜芦的质量控制研究

程 韬 王影超 陈韦佳 苌 玲 舒 柯*

1.贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学，贵州 贵阳 550025

藜芦在2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中系指藜芦VeratrumnigrumL.、黑紫藜芦Veratrumjaponicum(Baker)Loes.f.、蒙自藜芦VeratrummengtzeanumLoes.f.及狭叶藜芦VeratrumstenophyllumDiels的干燥根或根茎。秋季采挖，洗净，晒干，可催吐、祛痰、杀虫，用于中风痰涌、风痫癲疾、疥癣、恶疮[1]。本次实验研究的藜芦为藜芦VeratrumnigrumL.，由贵州省食品药品检验所李杨老师鉴定，藜芦中含有虎杖苷和白藜芦醇，虎杖苷具有较强的生物活性，对心肌细胞、血管平滑肌细胞、抗血小板聚集、改善微循环等有显著作用，此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用[2]。白藜芦醇具有抗癌、抗菌、抗炎、抗心血管疾病、抗衰老和抗神经退行性疾病等药理作用[3]，质量标准中有显微鉴别和理化鉴别，故增加TLC鉴别及虎杖苷和白藜芦醇的含量测定对完善藜芦的质量控制提供重要的科学依据。

1 仪器材料

1.1 仪器 ThermoFisher UItimate 3000高效液相色谱仪；梅特勒托勒多 MS202TS型电子天平(十万分之一)；梅特勒托勒多 XP26型电子天平(百万分之一)；KQ-500DB型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；millipore超纯水机。

1.2 材料 虎杖苷对照品(111575-200502)、白藜芦醇对照品(111535-201703)均来自中国食品药品检定研究院；藜芦(批号301)采自安顺市关岭县、藜芦(批号302)采自安顺市关岭县、藜芦(批号303)采自安顺市紫云县、对照药材由贵州省食品药品检验所李杨老师鉴定为藜芦VeratrumnigrumL.。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯，青岛海洋化工硅胶G薄层板。

2 方法与结果

2.1 藜芦的薄层色谱鉴别方法[4]取本品粉末 1 g，加浓氨试液1.5 mL使浸润，放置30 min，加二氯甲烷30 mL加热回流30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取藜芦对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5～l0 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(5∶3∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，再喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.2 藜芦的薄层色谱鉴别结果 经过薄层色谱对温度、湿度的方法学验证，图1表明此鉴别方法分离度良好，斑点清晰，信息全面，用于藜芦的薄层鉴别方法可行。

2.3 HPLC同时测定虎杖苷和白藜芦醇的方法[5-7]

2.3.1 波长选择 分别取虎杖苷、白藜芦醇对照品在200～400 nm波长范围内进行紫外波长扫描，虎杖苷和白藜芦醇均在306 nm处有较大吸收，又结合HPLC-DAD光谱图对比，确定306 nm为最佳检测波长。光谱图如图2所示。

2.3.2 色谱条件 色谱柱Thermo C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1进行梯度洗脱。检测波长：306 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取虎杖苷、白藜芦醇对照品，加甲醇制成每1 mL各含虎杖苷10 μg、白藜芦醇20 μg的混合溶液，摇匀，即得。

2.3.4 供试品溶液的制备 取过三号筛的粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足失去重量，摇匀，0.45 μm微孔滤过，即得(实验全程需避光操作)。

2.3.5 系统适应性试验 取对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，供试品色谱中呈现与虎杖苷对照品、白藜芦醇对照品保留时间相同的色谱峰。色谱图如图3所示。

2.3.6 线性关系实验 精密吸取虎杖苷对照品(0.2004 mg/mL)和白藜芦醇对照品(0.4056 mg/mL)各1 mL、2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得虎杖苷浓度分别为20.04 μg/mL、50.10 μg/mL、100.2 μg/mL、150.3 μg/mL、200.4 μg/mL；白藜芦醇浓度分别为40.56 μg/mL、101.4 μg/mL、202.8 μg/mL、304.2 μg/mL、405.6 μg/mL的对照品溶液，分别吸取上述对照品溶液各10 μL，按2.3.2色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，以对照品质量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制工作曲线，进行回归处理，虎杖苷回归方程为y=462.8668x+2159.6973(r=0.9998)，白藜芦醇回归方程为y=525.4858x-302.5944(r=0.9999)，结果表明虎杖苷在0.2004～2.004 μg范围内呈现良好的线性关系，白藜芦醇在0.4056～4.0560μg范围内呈现良好的线性关系。

2.3.7 精密度实验 分别精密吸取对混合照品溶液10 μL，在同一色谱条件下，连续进样6次，测定峰面积，虎杖苷对照品峰面积RSD%为1.0%，白藜芦醇对照品峰面积RSD%为0.9%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性实验 精密称取一份样品，按2.3.4制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，分别于配制后0、3、6、18、24 h，按2.3.2项下色谱条件进样测定，测定虎杖苷峰面积RSD%为1.7%，白藜芦醇峰面积RSD%为1.3%，结果表明供试品溶液中虎杖苷和白藜芦醇在24 h内稳定。

2.3.9 重复性实验 精密称取同一批号样品6份，按2.3.4方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，按2.3.2项下色谱条件进样测定，虎杖苷平均含量为0.3701 mg/g,RSD=0.5%，白藜芦醇平均含量0.8781 mg/g，RSD=0.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.10 回收率实验 精密称定已知含有量的样品(虎杖苷平均含量0.3701 mg/g、白藜芦醇平均含量0.8781 mg/g)6份，精密加入对照品虎杖苷0.240 mg，白藜芦醇0.483 mg，按2.3.4方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，按2.3.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果虎杖苷和白藜芦醇的平均回收率分别为99.6%和100.1%,RSD(n=6)分别为1.1%和0.95%，表明实验方法准确度较高，结果见表2。

表2 虎杖苷和白藜芦醇回收率实验

2.3.11 耐用性试验 分别采用3支不同品牌的C18色谱柱waters xbridge(4.6 mm×250 mm，5 μm)、迪马(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo(4.6 mm×250 mm，5 μm)在戴安U3000高效液相色谱仪上对同一批藜芦样品进行测定，精密吸取供试品溶液10 μL，按2.3.2色谱条件进样测定，记录峰面积，结果虎杖苷和白藜芦醇的RSD%分别为2.2%、2.0%。

2.4 样品含量测定结果 取上述3批藜芦药材，按2.3.4项下方法制备供试品溶液并测定色谱峰面积，计算藜芦药材虎杖苷和白藜芦醇的含量，结果见表3。

表3 样品测定结果

3 讨论

根据参考文献，选择甲醇-水、乙腈-水流动相按表1梯度洗脱表进行洗脱，结果乙腈-水在表1梯度洗脱条件下可以使供试品目标化合物有效分离，再选择乙腈-1%磷酸溶液、乙腈-2%磷酸溶液、乙腈-4%磷酸溶液照表1梯度洗脱表进行比较，结果上述各系统均可以使供试品目标化合物有效分离，峰型也较理想，但因乙腈-水系统配制方便，成本低，毒性低，故最终选择乙腈-水为最佳流动相系统。

虎杖苷和白藜芦醇对光照不稳定，在进行虎杖苷和白藜芦醇含量测定操作时均要避光操作，如不避光操作，对照品色谱图中会出现杂峰，疑为对照品在光照条件下被降解转化为其他化合物，后续会对供试品中化合物的光照降解途径进行进一步研究。

用甲醇、乙醇超声提取1 h，甲醇效果较好；再用25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇提取，结果用50%甲醇提取溶剂提取所测得的虎杖苷和白藜芦醇峰面积最高，含量较高，甲醇提取次之；但是在50%甲醇提取溶剂下反复进行准确度实验，虎杖苷的回收率满足要求，白藜芦醇的回收率仅为50%～60%，选用甲醇作为提取溶剂进行准确度实验，虎杖苷和白藜芦醇的回收率均能达到药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

本实验对藜芦VeratrumnigrumL.的TLC鉴别及HPLC含量测定的研究，方法可靠稳定，简便易行，可较全面、可靠地控制藜芦的质量，为其质量标准的提升制定提供可靠依据。