癌组织中KLF9、TFAP4基因表达在非小细胞肺癌患者预后中的应用价值

蔡卫梅,李伟伟,陆志红,杨留中

新乡医学院第一附属医院肿瘤科三病区(河南卫辉 453100)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌主要类型之一，早期易被忽略，大多患者就诊时进展至中晚期，常采用姑息性治疗，5年生存率<20%，预后较差[1]。而复发与转移是NSCLC治疗失败的主要原因，因此研究复发与转移的相关机制及预后的影响因素意义重大。Kruppel样转录因子9(Kruppel-like factor 9，KLF9)系基因调控因子，能通过转录激活域或转录抑制域与核定位信号发挥转录调节因子功能，在黑色素瘤、胰腺癌中表达异常，并能调控细胞增殖、迁移、侵袭[2-3]。转录因子激活增强子结合蛋白4(transcription factor activating enhancer binding protein 4，TFAP4)是碱性螺旋环-螺旋转录因子家族成员，在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要作用，其水平升高，可促进胃癌细胞迁移和侵袭[4-5]。但现阶段关于KLF9、TFAP4在NSCLC患者中与临床病理特征关系的研究较少，对预后的影响仍不明确，本研究对此进行探讨，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2014年1月至2016年8月收治的NSCLC患者94例作为研究对象，均符合NSCLC诊断标准[6]，入组时首次确诊，可耐受活检，无放化疗等相关治疗史，无肺结核，并同意配合随访，排除合并自身免疫疾病、存在认知、精神障碍者。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂、仪器 Trizol总RNA抽提试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、DNA marker(上海生工生物工程公司)；PCR仪(美国ABI公司，7500)；恒温振荡器(太仓市科教器材厂)；高速离心肌(Heraeus公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；调速振荡器(金华市富华仪器有限公司)。

1.2.2 检测方法 入组者均于入院后治疗前，活检采集NSCLC组织标本，放入液氮冷冻，标本采集前均无NSCLC相关治疗史。自液氮中取100 mg标本，研钵中迅速研磨至粉末，加入1 mL Trizol试剂，并转入1.5 mL EP管中，反复吹打至充分溶解，室温放置10 min。加入0.2 mL氯仿，低温充分震荡10 min，室温放置5 min，12 000 r/min离心15 min，可见样本分为3层，小心吸取上层水相至新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温放置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入用0.1%DEPC水配的70%乙醇 1 mL，7 500 r/min离心5 min，上清弃去，倒扣EP管吸干水分，空气干燥10 min。加入40 μL左右0.1% DEPC水溶解沉淀，吹打混匀，-80℃保存。逆转录前取2 μL总RNA溶液，采用紫外分光光度仪260与280 nm波长下测定OD值，以验证RNA纯度与浓度，OD260/280介于1.80～2.00为符合要求。取总RNA溶液10 μL，加入1 μL Oligo(dT)(0.5 μg/μL)、1 μL RNase free ddH2O，65℃温浴5 min，再冰浴30 s，加入5×Reaction Buffer 4 μL、M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL、dNTP Mix(10 mmol/L) 2 μL、RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL，内参β-actin上下游引物分别为5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′、5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′(205 kb)，KLF9上下游引物分别为5′-AGTACCGACCCATCCAGAC-3′、5′-GCCGTTCACCTGTATGCAC-3′(295 kb)，TFAP4上下游引物分别为5′-GCTGAGTCTCGGGGGTTAGT-3′、5′-GTGCCCTCTTTGCAACATTT-3′(128 kb)。反应体系包括引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液共20 μL，反应条件，95℃预变性3 min，95℃变性5 s，60℃退火/延伸31 s，溶解曲线分析95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，共42个循环，以2-ΔΔCt表示检测基因相对表达量。

1.3 观察指标 (1)比较两组年龄、性别、病理类型、TNM分期、淋巴结转移、分化程度、肿瘤最大径。(2)比较两组癌组织中KLF9、TFAP4 mRNA表达量。(3)分析NSCLC预后的相关影响因素。(4)癌组织中KLF9、TFAP4 mRNA与TNM分期、淋巴结转移、分化程度、肿瘤最大径的相关性。(5)比较KLF9、TFAP4 mRNA高危者、低危者生存曲线。

2 结果

2.1 癌组织及癌旁组织KLF9、TFAP4 mRNA表达水平 癌组织KLF9 mRNA表达水平低于癌旁组织，TFAP4 mRNA表达水平高于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

表1 癌组织及癌旁组织KLF9、TFAP4 mRNA表达水平比较

2.2 不同KLF9 mRNA表达水平患者临床病理特征 两组年龄、性别、病理类型相比，差异无统计学意义(P>0.05)；KLF9 mRNA高表达组肿瘤最大径、TNM分期、淋巴结转移比例、分化程度与低表达组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同KLF9 mRNA表达水平患者临床病理特征 例(%)

2.3 不同TFAP4 mRNA表达水平患者临床病理特征 两组年龄、性别、病理类型相比，差异无统计学意义(P>0.05)；TFAP4 mRNA高表达组肿瘤最大径、TNM分期、淋巴结转移比例、分化程度与低表达组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同TFAP4 mRNA表达水平患者临床病理特征 例(%)

2.4 癌组织中KLF9、TFAP4 mRNA与临床病理特征的关系 Pearson相关性分析，KLF9 mRNA与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤最大径呈负相关，与分化程度呈正相关，TFAP4 mRNA与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤最大径呈正相关，与分化程度呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 癌组织中KLF9、TFAP4 mRNA与临床病理特征的关系

2.5 生存分析 随访期间，脱落5例。KLF9 mRNA、TFAP4 mRNA高表达与低表达患者生存曲线比较，差异有统计学意义(2=6.735、5.833，P=0.009、0.016)，见图1、2。

图1 KLF9 mRNA高、低表达患者生存曲线

图2 TFAP4 mRNA高、低表达患者生存曲线

3 讨论

NSCLC具有发病率高、预后差等特点。尽管现有诊疗技术不断进步，但NSCLC患者生存率提高程度有限，因此研究NSCLC分子水平相关机制，为靶向性治疗提供思路，对改善患者预后至关重要。

3.1 癌组织中KLF9基因表达及与NSCLC患者预后的关系 KLF9羧基末端含有3个由高度保守的氨基酸组成的锌指结构，锌指结构内部存在核定位信号，具有增强或抑制靶基因转录的作用，在机体重要器官发育、细胞增殖、分化、凋亡中扮演重要角色[7-8]。Kong等[9]研究显示，KLF9在NSCLC组织和细胞系中呈低表达，采用小RNA技术靶向KLF9，可影响癌细胞增殖和侵袭，提示KLF9与NSCLC临床病理特征有关，可能会影响患者预后。本研究显示，KLF9 mRNA高表达组肿瘤最大径、TNM分期、淋巴结转移比例、肿瘤最大径与低表达组相比，差异显著，与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤最大径呈负相关，与分化程度呈正相关，提示KLF9 mRNA表达可影响NSCLC患者肿瘤分期、大小、转移、分化程度，故与预后密切相关，上调KLF9 mRNA表达可能有助于患者临床病理特征及预后的改善，为基因靶向治疗提供了一个方向。郝登荣等[10]报道显示，NSCLC组织中KLF9阳性率明显低于癌旁组织，有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者KLF9 mRNA水平低于无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者，本研究结论与之一致。KLF9影响预后的机制可能为：(1)KLF9能通过转录特异性结合基质金属蛋白酶28的启动子区域，调控基质金属蛋白酶28表达，从而抑制癌细胞的侵袭和转移[11]。(2)KLF9能通过调节氧化应激，促进癌细胞的凋亡[12]。同时本研究发现，KLF9 mRNA高表达者生存曲线优于低表达患者，直接佐证了KLF9 mRNA高表达有利于预后的改善。

3.2 癌组织中TFAP4基因表达及与NSCLC患者预后的关系 TFAP4能识别并结合DNA[13]。Yang等[14]研究显示，TFAP4在结直肠癌中呈高表达，沉默TFAP4表达可抑制结直肠癌细胞的侵袭与迁移，提示TFAP4与结直肠癌生物学行为有关，但在NSCLC中的报道较少。本研究发现，TFAP4 mRNA高表达组肿瘤最大径、TNM分期、淋巴结转移比例、肿瘤最大径与低表达组相比差异显著，TFAP4 mRNA与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤最大径呈正相关，与分化程度呈负相关，提示抑制TFAP4 mRNA表达有助于改善患者临床特征与预后。Wei等[15]报道显示，与TFAP4低表达患者相比，TFAP4高表达结直肠癌患者的总生存时间显著减少，是总生存时间的独立影响因素，支持本研究结论。结合相关文献，TFAP4能调控上皮-间质化过程多种基因表达，使细胞连接与极性丧失，为肿瘤细胞侵袭提供便利，且TFAP4参与细胞增殖的调控，在细胞分裂增殖的G2阶段，TFAP4可导致染色体错聚和多极纺锤体，最终激活DNA损伤反应，导致细胞周期阻断被去除，细胞增殖持续进行，从而促进癌细胞的增殖、淋巴结的转移[16-17]。同时本研究显示，TFAP4 mRNA低表达患者生存曲线优于高表达者，直接证实TFAP4 mRNA低表达可改善预后。本研究不足之处在于，样本量较小，且癌组织的获取具有有创性，有待后续扩大病例数，进行验证、完善。

NSCLC患者癌组织中KLF9、TFAP4基因表达与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤最大径、分化程度显著相关，可影响患者预后，靶向KLF9、TFAP4基因可能有助于预后的改善。