山羊产气荚膜梭菌的分子流行病学调查与毒素型分析

曹思宇，张彤宇，2，张 燕，成大荣，3*，邢 华，3*

（1．扬州大学兽医学院，江苏 扬州225009；2．南京传奇生物科技有限公司，江苏 南京211100；3．江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州225009）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，C.perfringens）又称魏氏梭菌，在自然界分布广泛，存在于污水、土壤、人畜粪便及肠道中，是一种人畜共患病原菌[1-2]。产气荚膜梭菌严重影响畜禽的健康养殖，给养殖业造成重大经济损失，同时也对人类健康造成极大威胁[3-4]。产气荚膜梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性杆菌，可形成芽孢，其能产生多种外毒素和侵袭性酶类，主要有α、β、ε、ι4种致病性毒素[5]。根据致死性毒素及抗毒素中和试验，将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E 5种毒素型[6]。其中，A型携带α毒素，主要引起易感动物的坏死性肠炎[7]；B型携带α、β、ε毒素，其中β毒素有较强的致死性；C型携带α、β毒；D型携带α、ε毒素，其中ε毒素是仅次于肉毒毒素和破伤风毒素的梭菌强毒素[8]；E型携带α、ι毒素。B型和D型产气荚膜梭菌感染易引起牛、羊的肠炎或肠毒血症，E型临床致病较少。产气荚膜梭菌可以形成芽孢，能够稳定长期的存在于易感动物和环境中，对易感动物造成极大的威胁。因此，本试验采集江苏地区及扬州大学动物医院的山羊新鲜粪便进行PCR核酸检测，对阳性的菌株进行毒素型鉴定，为该地区的山羊产气荚膜梭菌的分子流行病学的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在江苏灌云、扬州、宿迁、泰州、连云港等10个地区的肉羊规模养殖场经直肠采集新鲜粪样1 114份，其中健康粪便样品971份，发病粪便样品143份。置于密封袋或灭菌的Ep管，4℃保存。

1.2 样品处理

取粪球与少量生理盐水混合后，用接种环蘸取混合物接种于梭菌增菌培养基中培养。采用煮沸法对增菌后的细菌总DNA提取。

1.3 引物合成与反应条件

参考张彤宇[9]的试验方法合成产气荚膜梭菌通用引物，反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55.9℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环；72℃延伸2 min。根据产气荚膜梭菌的α、β、ε、ι4种毒素基因序列，参照鲍长磊等[10]的试验方法合成基因分型引物。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物均用1%琼脂凝胶电泳检测。

1.4 阳性菌株的分离与鉴定

挑取梭菌检测呈阳性的增菌培养物，在卵黄CW琼脂平板（含卡那霉素）上四区划线分离培养，挑取分离出的可疑菌落接种进行增菌[11]，提取DNA模板，经PCR电泳验证。同时，挑取可疑菌落经革兰染色法、亚甲基蓝染色法、生化鉴定、牛乳发酵试验后观察。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果（见图1）

1 114份样品用梭菌经PCR检测，213份（19.12%）呈阳性，其中208份（21.42%）来源于健康肉羊，5份（3.50%）来源于发病肉羊。

图1 产气荚膜梭菌的PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amplification of C.perfringens

2.2 产气荚膜梭菌的分离鉴定与毒素型分析（见图2）

图2 分离株的PCR产物电泳图Fig.2 PCR product electrophoretogram of isolated strain

由图2可知，对分离鉴定后得到的108株产气荚膜梭菌用PCR鉴定，A型产气荚膜梭菌67（62.04%）株、D型产气荚膜梭菌41（37.96%）株，未见其他型菌株。

2.3 不同地区产气荚膜梭菌的检测结果（见表1）

表1 不同地区产气荚膜梭菌的检测结果Tab.1 Prevalence of C.perfringens in different regions

由表1可知，各个地区受检样品中产气荚膜梭菌阳性率不等，最高的地区为灌云，其次为扬州。

3 讨论

产气荚膜梭菌可引起多种人兽共患传染病，临床症状不明显，易引起死亡，已成为危害人类及养殖业的重要疾病之一。产气荚膜梭菌所分泌的外毒素是其主要致病因子[12]，多作用于肠道，造成感染动物的急性死亡，其中A型梭菌易引起气性坏疽和食物中毒[13]；D型梭菌易引起肠毒血症[14]。另外，不同毒素型对药物的敏感性不同，应严格分型后指导养殖户正确使用药物及疫苗，防止疾病发展[15]。

本试验对临床粪便样品进行检测，结果显示，产气荚膜梭菌在江苏肉羊规模化养殖场流行广泛，健康羊群普遍携带产气荚膜梭菌，且至少存在2种毒素基因型。从不同地区肉羊产气荚膜梭菌检测结果可知，阳性率有所不同，最高的地区为灌云，其次为扬州。对各地区毒素分型鉴定发现，各地区均携带A型菌，扬州、泰州和南通除A型以外还携带D型菌，可能与规模化养殖场的饲养环境、地理位置有关。

产气荚膜梭菌是构成动物肠道菌群的一部分，当机体处于健康情时该菌不会引起疾病，但当动物处于亚临床状态或爆发坏死性肠炎时，胃肠道的菌群平衡被打破，菌群失调，产气荚膜梭菌会快速增殖并产生大量毒素，对机体造成损伤。

4 结论

江苏地区被检的临床健康肉羊广泛携带产气荚膜梭菌，且大多携带A型，少部分携带D型。为避免疾病的大规模爆发，除注意饲养管理外，需针对菌株的不同毒素型提早预防，并采取相应的控制措施。