高效液相色谱法分析中国人参不同部位中多酚类化合物

徐艳阳，赵玉娟，高 峰，王二雷，鲁海玲，李雪凤，姜雯雯，陈 艳,*

（1.吉林大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130062；2.珲春华瑞参业生物工程股份有限公司，吉林 珲春 133000）

人参是一种多年生草本五加科人参属植物（Panax ginsengC.A.Meyer），其根为圆柱形或纺锤形，末端多分枝，外皮淡黄色；人参茎直立，圆柱形，人参叶为掌状复叶，有长柄[1-2]，素有“百草之王”的美称，是我国传统的滋补养生名贵药材。世界人参的主产区在中国东北、朝鲜、韩国、日本、俄罗斯东部以及美国和加拿大[3]。中国人参的产量占世界总产量的70%，主产区在吉林省，其中长白山区产量占85%。作为中国民族品牌的“长白山人参”，在2011年已成为注册商标，同时被列为地理标志产品，同时，吉林省已将“长白山人参”区域公用品牌作为实施品牌发展战略的重点工作之一[4-5]。2012年我国批准种植的人参为新资源食品后，人参的应用也由单一的中药材拓展到食品、饮料及保健产品等多个领域，为我国人参产业的跨越式发展提供了新契机[6]。

现代医学研究证明，人参具有多种生物学和药理特性，如免疫刺激、抗癌、止吐、抗氧化等[7-11]。这些特性与人参中的化学成分密切相关，如人参皂苷、人参多糖、生物碱、游离氨基酸、多酚以及柠檬烯等挥发性化合物[12-14]。其中多酚类化合物是植物的次生代谢产物，大部分由苯丙氨酸衍生而来，少部分由酪氨酸衍生而来。按其结构不同可分为类黄酮、木聚素、酚酸和木酚素[15]。然而，与人参皂苷相比，人们对人参中多酚类化合物的了解相对较少。韩国在前期开展了部分研究，如研究发现人参中对·NO起清除作用的为多酚类物质，特别是对香豆酸和香草酸，而非人参皂苷。此外，生晒参提取物中的酚类化合物显示出较强的去色素、改善氧化应激及降低动脉粥样硬化特性，并且对大鼠肝微粒体脂质的氧化具有较强的抑制作用[16-20]。Chung等[21]采用高效液相色谱法对不同生长年限以及人参不同部位中的多酚类化合物进行测定，发现人参叶中含有丰富的绿原酸、间香豆酸和对香豆酸。Choi等[22]发现人参叶中含有大量的对香豆酸，人参果中酚酸主要以肉桂酸为主。Jung等[23]通过高效液相色谱法分析发现红、白人参根中的7 种主要游离酚酸中，以顺式阿魏酸为主，酯化酚酸中以反式阿魏酸为主。长白山人参因产量高、质量佳在世界上享有盛名。另外，金学俊[24]、曾露露[25]等只对人参茎叶及黑参中的总多酚含量进行了测定，其他鲜见报道。因此，本实验以长白山人参为研究对象，应用高效液相色谱系统分析红参根、生晒参根、人参茎、人参叶、人参花和人参须中的多酚类化合物含量和种类，以期为长白山人参的深加工和综合开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红参根、生晒参根、人参茎、人参叶、人参花、生晒参须由珲春华瑞参业生物工程股份有限公司提供。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Fisher公司；原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、间香豆酸、邻香豆酸、肉桂酸、柚皮苷、儿茶素、柚皮素、芒柄花黄素、麦芽酚、橙皮素、甲基香兰素、白藜芦醇（HPLC≥98%）、纤维素酶（50 000 U/g）、果胶酶（50 000 U/g） 上海源叶生物科技有限公司；磷酸、无水乙醇、硫酸铵（均为分析纯） 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

SJIA-10N-50A冷冻干燥机 宁波双嘉仪器有限公司；PH070A型电热鼓风恒温干燥箱 上海一恒科技有限公司；LD4-2A型低速离心机 北京市雷勃尔离心机有限公司；FW177型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；AL104型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；QL-901型试管振荡器 金坛市医疗仪器厂；UV-4802型紫外-可见分光光度计 尤尼科（上海）仪器有限公司；KQ-250DB型超声波清洗器 江苏省昆山市超声仪器有限公司；LC-30A高效液相色谱仪 日本岛津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供试样品溶液的制备

人参粉末制备：人参根、茎、叶、花、须→粉碎→过筛（60 目）→人参粉末。

称取人参粉末0.50 g，经0.30 mg/mL纤维素酶-果胶酶配比为1∶2（g/g）复合酶溶液40 mL进行酶解，酶解pH值为4.5，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h，过滤，收集滤液。在滤渣中加入70%乙醇溶液15 mL，50 ℃浸提30 min，抽滤，合并所有提取液，减压蒸馏，回收溶剂，浓缩提取液冻干后得到冻干样品，储存备用。称取冻干样品0.100 g，用甲醇配成10 mg/mL供试样品溶液。

1.3.2 人参样品中总多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteus比色法测定，原理为在碱性溶液中多酚类化合物可将磷钨酸钠还原并生成蓝色化合物，根据颜色的变化在波长765 nm处进行比色测定。以没食子酸为标准物质，参考GB/T 8313ü 2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[26]建立标准曲线。称取（0.110 0f 0.000 1）g没食子酸于100 mL容量瓶，溶解并定容至刻度，摇匀，配成1 000 μg/mL没食子酸标准储备溶液。用移液管分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL没食子酸标准储备溶液于100 mL容量瓶中，分别用水定容至刻度，摇匀得到质量浓度分别为10、20、30、40、50 μg/mL没食子酸工作液。用移液管分别移取不同质量浓度的没食子酸工作液、水（作空白对照）及测试液各1 mL，于刻度试管内，再分别加入5 mL福林-酚试剂，摇匀。反应3～8 min，加入4 mL 7.5%碳酸钠溶液，加水至刻度、摇匀。室温下放置60 min。在765 nm波长处测定吸光度。根据没食子酸工作液的吸光度与对应的质量浓度制作标准曲线。按标准曲线的制作方法，测定冻干样品的吸光度，样品中总多酚含量按下式计算：

式中：Y为样品中总多酚含量/（mg/100 g）；C为样液中总多酚的质量浓度/ （μg/mL）；V为样液体积/mL；N为稀释倍数；m为样品的质量/g；100为样品质量/g。

1.3.3 人参样品中18 种多酚类化合物的检测

1.3.3.1 标准品溶液及样品溶液的制备

精密称取原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、间香豆酸、邻香豆酸、肉桂酸、柚皮苷、儿茶素、柚皮素、芒柄花黄素、麦芽酚、橙皮素、甲基香兰素、白藜芦醇标准品20.00 mg，分别用甲醇溶解并定容至10 mL作为标准品母液。采用梯度稀释法用甲醇将各标准品母液配制成一系列质量浓度梯度的标准品溶液，备用。

称取冻干样品粉末0.100 g，用甲醇定容至10 mL容量瓶中。0.22 µm微孔滤膜过滤，作为检测待测液。

1.3.3.2 色谱条件

色谱柱Symmetry®C18柱（4.6 mmh 150 mm，5 μm），流动相0.1%磷酸（A）和乙腈（B），检测波长2 3 0 n m，柱温3 0 ℃；进样量1 0 μ L；流速0.8 mL/min；梯度洗脱：0～7 min，85% A，15% B；7～17 min，70%～85% A，30%～15% B；17～27 min，5 1%～7 0% A，4 9%～3 0% B；2 7 ～3 0 m i n，4 5%～5 1% A，5 5%～4 9% B；3 0 ～3 5 m i n，3 0%～4 5% A，7 0%～5 5% B；3 5 ～4 0 m i n，30%～85% A，70%～15% B；40～45 min，85% A，15% B。

1.3.3.3 方法学考察

标准曲线的绘制：参考邓俊琳等[27]方法，精密吸取含有18 种多酚化合物的混合标准品，分别稀释至5、10、15、20、25、30 µg/mL，在1.3.3.2节色谱条件下进样测定，计算峰面积。以标准品质量浓度（X，µg/mL）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。

重复性实验：按照1.3.3.1节方法平行制备6 份人参叶多酚类化合物待测液，按1.3.3.2节色谱条件进样10 µL进行测定，计算18 种多酚类化合物的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

精密度实验：按照1.3.3.1节方法制备的标准品溶液，按1.3.3.2节色谱条件连续进样6 次，计算18 种多酚类化合物峰面积的RSD。

稳定性实验：按照1.3.3.1节方法制备的标准品溶液，按1.3.3.2节色谱条件对同一样品分别在0、2、4、6、8 h进样10 µL，计算18 种多酚标准品峰面积的RSD。

回收率实验：称取人参叶多酚样品适量于具塞锥形瓶中，加入18 种标准品适量，按1.3.3.1节的方法制备人参叶多酚提取物样品，再按1.3.3.2节色谱条件进样10 µL，并计算18 种多酚类化合物的加标回收率。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 人参各部位中总多酚含量的测定

没食子酸标准曲线的回归方程为Y=0.011 7X+0.034 9（R2=0.999 6），由回归系数可知，没食子酸质量浓度在0～50 µg/mL范围内线性关系良好，可以用于样品总多酚含量的测定。如图1所示，人参叶中总多酚的含量显著高于其他部位（P＜0.05），为红参根中总多酚含量的3.7 倍（P＜0.05）。人参茎和人参花中总多酚的含量接近，但显著高于红参根、生晒参根和人参须，分别是红参根的2.5 倍，生晒参根、人参须的1.8 倍（P＜0.05）。

图1 人参不同部位中总多酚含量Fig.1 Total polyphenol contents of different parts of ginseng

2.2 多酚标准品溶液和人参样品的高效液相色谱检测

从图2可以看出，在色谱条件1.3.3.2节下，18 种多酚类化合物的标准品得到较好分离，人参各部位溶液的色谱图中目标峰的保留时间与多酚单体标准品的色谱峰一致。在此色谱条件下，红参根、生晒参根、人参茎、人参叶、人参花和人参须中18 种多酚类化合物得到较好分离。因此，根据每种多酚单体的保留时间和紫外吸收光谱的特征吸收波长对人参样品中18 种多酚单体分别进行定性。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线

18 种多酚标准品的标准曲线如表1所示。由回归系数（R2＞0.980 7）可知，18 种多酚类化合物质量浓度在5～30 μg/mL范围内线性关系良好。

表1 18 种多酚标准品的回归方程、相关系数、检测范围Table 1 Calibration curve equations, correlation coefficients, and linear ranges of 18 polyphenols

2.3.2 重复性、精密度及稳定性实验结果

表2 18 种多酚类化合物的重复性、精密度及稳定性实验结果Table 2 Repeatability, precision and stability for determination of 18 polyphenols

由表2 可知，1 8 种多酚类化合物的R S D 为0.25%～3.49%，均小于5%，表明该测定方法重复性良好。18 种多酚类化合物峰面积的RSD为0.52%～3.02%，均小于5%，表明测定方法的精密度良好。18 种多酚类化合物峰面积的RSD为0.52%～2.58%，均小于3%，表明18 种多酚在测定时间8 h内稳定性良好。

2.3.3 回收率实验结果

表3 18 种多酚标准品在人参叶样品中的加标回收率（n= 5）Table 3 Recoveries of phenolic compounds from spiked ginseng leaves (n= 5)

由表3可知，18 种多酚类化合物的加标回收率在84%～99%之间，RSD均小于5%，表明本实验方法有较好的回收率，结果准确可靠。

2.4 人参不同部位中多酚类化合物含量的测定

由表4可知，不同部位的人参样品中，18 种多酚类化合物中均以麦芽酚含量最高（P＜0.05），其次是儿茶素。人参花和人参须中的总酚酸含量高于人参叶、人参茎（P＜0.05），红参根、生晒参根中的总酚酸含量较低。人参花中的总黄酮含量高于红参根、生晒参根（P＜0.05），人参茎、人参叶、人参须中的总黄酮含量较低。本实验测定结果的排序与Chon等[28]对高丽参各部位的多酚类化合物含量测定接近。Chung等[29]通过高效液相色谱法对高丽参叶中的23 种多酚类化合物进行分析，结果表明，高丽参叶中的原儿茶酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、龙胆酸、阿魏酸、柚皮苷、肉桂酸和儿茶素含量分别为30.41、1.37、9.82、17.97、3.37、1.30、0.93、4.96 µg/g，均低于中国人参。

另外，红参根中的麦芽酚、儿茶素和原儿茶酸含量较高，分别为0.976 3、0.499 6、0.194 2 mg/g。其中红参根中麦芽酚的含量高于Kong等[30]测定的数据（0.518 mg/g）。生晒参根中麦芽酚的含量最高，其次为儿茶素、龙胆酸。红参根中未测到阿魏酸，与Chung等[21]的研究结果不同，我国生晒参根中阿魏酸含量低于测定的干白参根。这可能与多酚类化合物的提取方法和人参的种类、生长环境等有关。人参茎中的麦芽酚含量最高（P＜0.05），其次儿茶素含量较高。人参叶中主要以麦芽酚、儿茶素、原儿茶酸为主。人参花中主要多酚类化合物为麦芽酚、儿茶素、原儿茶酸以及对羟基苯甲酸，其中对羟基苯甲酸占18 种多酚化合物含量总和的46.08%。人参须中麦芽酚、龙胆酸、柚皮苷、丁香酸、儿茶素和原儿茶酸含量丰富。

表4 人参不同部位中多酚类化合物含量（n=3）Table 4 Polyphenol contents in different parts of ginseng (n= 3) mg/g

表5 各文献中对人参中总多酚及总皂苷含量的对比Table 5 Contents of total polyphenols and total saponins in ginseng measured by the HPLC method and those reported in the literature

本实验和其他文献中关于人参中总多酚及总皂苷含量的测定结果如表5所示。由表5可知，人参中总多酚及总皂苷的含量不同，这与人参的种类、生长年限、水分含量、提取方法、测定方法和环境等因素有关。

3 结 论

本实验应用Folin-Ciocalteus比色法对长白山人参不同部位中总多酚的含量进行测定，结果表明红参根、生晒参根、人参茎、人参叶、人参花、人参须中的总多酚含量依次为（69.47f 3.25）、（95.04f 5.03）、（1 7 5.1 9 f 3.2 6）、（2 5 6.9 1 f 2.8 1）、（174.40f 6.26）、（99.31f 2.90）mg/100 g。其中人参叶中总多酚含量最高，其次为人参茎、花，红参根、生晒参根、人参须中的总多酚含量较低。

本实验建立一种同时测定长白山人参各部位中原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、龙胆酸、对香豆酸、阿魏酸、间香豆酸、柚皮苷、甲基香兰素、邻香豆酸、白藜芦醇、肉桂酸、麦芽酚、儿茶素、柚皮素、芒柄花黄素和橙皮素18 种多酚化合物含量的高效液相色谱分析方法，各成分的峰形和分离度较好，保留时间稳定。以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，18 种多酚化合物的出峰时间均在35 min内，且与相邻峰的分离度良好。18 种多酚化合物在波长230 nm处有较大的吸收，且色谱图的基线较为平稳。18 种多酚类化合物在长白山人参的各部位中，麦芽酚含量最高（P＜0.05），其次为儿茶素。人参花中的总酚酸含量高于人参叶和人参根（P＜0.05）；人参根中的总黄酮含量高于人参叶（P＜0.05）。该方法准确性高、重复性好，可为有效控制人参多酚的质量提供依据。