基于Nrf2/HO-1 通路比较雷公藤与及己根水提取物对大鼠的肾毒性

夏荣平，孙淑萍，张家豪，李佳荣，曹雯静，许珊珊，靳珊珊

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）隶属于卫矛科雷公藤属，其去皮后的根入药可用于治疗炎症性疾病，临床上常用于湿热结节、关节炎和跌打损伤等疾病的治疗［1］.临床研究［2-3］表明，患者在服用雷公藤后出现一些明显的不良反应症状.主要特征为：胃肠道反应、谷丙转氨酶明显升高（约2 倍）、心血管疾病等.一些女性患者甚至出现了月经紊乱、皮肤粘膜受损、脱发.本课题组前期的研究［4］也证实了雷公藤提取物在一定的剂量范围内对大鼠肾脏具有明显毒性作用，故需要严格控制其剂量，做好临床监测工作.

及己（Chloranthus serratus Roem.et Schult）隶属于金粟兰科金粟兰属，以其具有抗菌消炎、舒筋活络等作用的根或全草入药，可以治疗风湿疼痛及相关炎症疾病［5］.及己既可以内服也可以外用，但及己根有毒，过量服用会引起呕吐、意识模糊、心外膜内出血、肺出血及肾功能损伤等症，严重者会导致死亡［6］.

本课题组前期研究发现，雷公藤和及己均能用于治疗炎症疾病，且都具有一定的肾毒性［4-5］.而目前有关雷公藤、及己的毒性报道多为肝毒性和心脏毒性，对肾毒性方面的研究相对缺乏.因此，本研究选择了氧化应激损伤和Nrf2/HO-1 信号通路作为雷公藤和及己根水提取物致损伤的切入点来比较两者引发的大鼠肾毒性大小，从而推断及己是否有替代雷公藤用于临床治疗的可能，也为后期医疗人员应用及己治疗相关炎症疾病奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

（1）主要仪器.酶标仪（深圳山特电子有限公司）；显微镜（CKX3OLYMPUS，昆山诺普森实验室用品科技有限公司）；电泳仪（Biorad，深圳市宇德立生物科技有限公司）；自动曝光仪（Amersham Imager 600，General Electric Company）；高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）等.

（2）药材.试验药材均为2013 年购自安徽亳州中药材市场，符合《中国药典》2015 版一部质量标准.将中药及己根与雷公藤清洗干净，待风干后粉碎成粗粉，室温干燥保存.定量称取雷公藤粗粉500 g，回流提取三次：分别用12 倍量水、10 倍量水、8 倍量水，提取1.5 h、1 h、1 h.将滤液合并，浓缩至黏稠状，然后置于干燥箱（45 ℃），干燥好后粉碎过筛（80目），得雷公藤水提取物（LS）.及己根水提取物（GS）制备方法同上.药物提取率（%）=水提取物重量（g）/粗粉重量（g）×100%.及己根、雷公藤的药物提取率分别为14.2%、13.8%.

（3）试剂.尿酸（UA）、肌酐（CR）试剂盒（RCL0248、RCL0246，上海容创生物技术有限公司）；尿素氮（BUN）试剂盒（2014007，长春汇力生物技术有限公司）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（20190613、20190616，南京建成生物工程研究所）；核因子E2 相关因子2（Nrf2）一抗（美国Proteintech公司，16396-1-AP）；鼠来源β-actin 一抗（批号：66240-1-LS）、HRP-羊抗鼠IgG（批号：BST12F21C50）、兔来源血红素加氧酶-1（HO-1）一抗（批号：ZP1039BP39）、HRP-羊抗兔IgG（批号：BST12L05A54）、转化生长因子TGF-β1一抗（批号：BST12F21C49），均买自武汉BOSTER生物工程有限公司.

（4）实验动物.30 只SD 雄性大鼠，鼠龄为6 周，体质量为（190±10）g.实验大鼠采购于山东省实验动物中心，批号：SCXK（鲁）2014-0007.饲养环境：室温、通风、正常进行饮食，实验前适应性喂养7 d.

1.2 急性毒性实验

实验开始前，分别向两组大鼠灌胃给予相应浓度的药物提取物（GS 溶液浓度为38.3 g/kg、LS 溶液浓度为37.3 g/kg）.如果大鼠未出现死亡，则另取2 只灌胃给予GS 溶液，2 只灌胃给予LS 溶液，观察这些大鼠在48 h 内的总体状态变化和死亡率.

1.3 实验分组及给药

将大鼠按随机数字表随机均分为3 组：空白（KB）组、及己根水提取物（GS）组和雷公藤水提取物（LS）组，每组10 只.按照人和动物体表面积比值剂量表［7］和预实验结果，确定实验大鼠给药剂量（提取物质量，g/kg）为：成人给药剂量3 g（原药材）×换算系数（0.018）×药材提取率（GS 提取率为14.2%，LS 提取率为13.8%）×倍数（100）×5；5 为200 g 大鼠用药量转化成1 kg 大鼠用药量，即GS 组为3.83 g/kg、LS 组为3.73 g/kg.每天分别将及己根与雷公藤水提取物灌胃给予GS 组和LS 组大鼠，KB 组给予等量的蒸馏水，持续给药两周.

1.4 大鼠日常状况观察

每日给药时通过观察大鼠的毛色、进食、进水、日常活动及精神等基本状况，判断其是否出现毒性症状，并从初次给药之日起，隔日记录一次各组大鼠的体重，计算出各组大鼠的体重变化率.体重变化率（%）=（实验开始后某一天的体重-第一天的体重）/第一天的体重×100%.

1.5 样本的采集和肾功能检测

给药 第15 天，按0.4 mL/100 g 的 剂量，用25%乌拉坦溶液腹腔注射，使大鼠麻醉，进行眼球取血.将取好的血液离心15 min（4 ℃、3 000 rpm），取其上清液，按照试剂盒说明书用酶标仪测BUN、CR 和UA 含量.

取血后将大鼠处死并收集肾脏组织，洗净吸干后称重，计算肾脏系数.肾脏系数（%）=肾脏质量（g）/大鼠质量（g）×100%.取大鼠左侧肾脏组织，用10%甲醛溶液进行固定后使用常规HE 染色并进行病理检查，其余保存在-80 ℃冰箱.

1.6 大鼠肾脏匀浆中MDA和T-SOD含量测定

取适量保存的肾脏组织复温，按质量体积比为1∶9 加入冰生理盐水进行匀浆.于4 ℃、2 500 rpm 下将肾脏组织匀浆液离心20 min.取上清液按相应的试剂盒说明书测定MDA 和T-SOD 含量.

1.7 大鼠肾脏微结构病变观察

取1.5 中固定的肾脏组织，梯度乙醇进行脱水，用石蜡进行包埋制片（约5 μm）.将制好的切片进行脱蜡、醇化、HE 染色，彻底脱水、透明及封片后于显微镜下观察，以确定是否出现炎性细胞、血管扩张充血和脂肪变性等病理学改变.

1.8 免疫组化法检测大鼠肾脏中TGF-β1 阳性表达情况

将1.7 中制作的石蜡切片脱蜡、梯度乙醇复水、枸橼酸热修复、3% H2O2溶液灭活内源性酶、血清封闭后，进行一抗孵育过夜（4 ℃）和二抗孵育，滴加SABC 和显色液，复染、封片.显微镜下观察并拍照，选择具有代表性的免疫组化图片，采用Image J 软件读取三次免疫组化图片的阳性表达百分率，并用SPSS 23.0软件对所得结果进行统计分析.

1.9 Western bloting 检 测Nrf2/HO-1 通 路 蛋白含量

取适量1.5 中的肾脏组织，加入250 μL 裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），冰水浴研磨匀浆20 min 后离心20 min（4 ℃、12 000 rpm），收集上清液于EP 管中，进行BCA 蛋白含量测定，加入4 倍体积的上样缓冲液，然后于沸水浴中加热进行变性.以蛋白含量40 μg/孔，并在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳40 min 后110 V恒压转膜（NC 膜）70 min.将NC 膜用5%脱脂牛奶封闭2 h 之后一抗（Nrf2、HO-1、β-tubulin、β-actin）孵育过夜（4 ℃），清洗，孵育二抗2 h后滴加发光液曝光，用Image J 软件获取曝光后各条带的灰度值，并进行统计分析.

1.10 统计学分析

所有数据均用SPSS 23.0 软件处理，结果以平均值±标准差表示.单因素方差分析用于多组样本之间均数的比较，采用LSD 进行事后检验.P值小于0.05，表示具有显著性差异.

2 结果

2.1 大鼠急性毒性实验

GS组和LS组大鼠的用药量分别为3.83 g/kg和3.73 g/kg 时，不会造成大鼠死亡.同时，实验结果显示，GS 组和LS 组大鼠的LD50分别高于3.83 g/kg 和3.73 g/kg.因此，最终选择GS 组3.83 g/kg 和LS 组3.73 g/kg 作 为 评 估GS、LS 致大鼠肾毒性大小的剂量.

2.2 大鼠日常状况观察

KB 组大鼠饮食规律、精神饱满、毛发光滑有光泽；与KB 组相比，GS 组大鼠饮食、毛发未见明显异常；LS 组大鼠饮食减少、精神萎靡、大便黏稠、有掉毛现象.

2.3 大鼠体重变化趋势

从第3 d 到第15 d，KB 组大鼠体重增长率高于GS 组和LS 组，且组间差距从第13 d 开始逐步增大.GS 组大鼠体重增长较平稳，但其体重变化率在实验后期较KB 组极显著降低（P<0.01），LS 组体重增长率后期较KB 组和GS 组极显著降低（P<0.01），见图1.

图1 KB、LS、GS 组大鼠体重变化率曲线

2.4 对肾脏系数的影响

与KB 组相比，LS 组能诱导较GS 组更明显的大鼠肾脏系数的上升（P<0.05），见图2.

图2 各组大鼠肾脏系数

2.5 对肾脏MDA 和T-SOD 含量的影响

与KB 组相比，LS 组大鼠T-SOD 含量的降低和MDA 含量的上升均较明显（P<0.01）；GS组中T-SOD 和MDA 含量均降低，但无统计学意义，见表1.

表1 大鼠肾脏匀浆中T-SOD 和MDA 含量（，n=10）

表1 大鼠肾脏匀浆中T-SOD 和MDA 含量（，n=10）

注：与KB 组相比，**P<0.01；与GS 组相比，##P<0.01.

组别KB LS GS剂量/（g·（kg·d）-1）/3.73 3.83 T-SOD/（U·mgprot-1）119.80±8.96 74.42±4.55**##118.96±5.29 MDA/（nmol·mgprot-1）2.50±0.18 5.78±0.32**##2.48±0.16

2.6 对血清中BUN、CR 和UA 含量的影响

与KB 组相比，LS 组和GS 组的CR 和UA水平均极显著升高，而BUN 水平仅LS 组升高明显（P<0.01）；与GS 组相比，LS 组UA 和BUN水平极显著升高（P<0.01），见表2.

表2 大鼠血清中BUN、CR 和UA 的含量（，n=10）

表2 大鼠血清中BUN、CR 和UA 的含量（，n=10）

注：与KB 组相比，**P<0.01；与GS 组相比，##P<0.01.

组别KB LS GS剂量/（g·（kg·d）-1）/3.73 3.83 BUN/（mmol·L-1）5.76±0.94 16.90±1.00**##6.90±0.57 CR/（μmol·L-1）24.20±0.89 31.95±1.20**31.10±1.10**UA/（μmol·L-1）270.00±3.57 1 157.45±1.98**##398.00±5.95**

2.7 对肾脏组织形态的影响

显微镜下，KB 组组织结构未观察到明显异常，毛细血管未见充血和扩张，肾小球大小形状也趋于正常；LS 组皮质部分存在大量炎性细胞浸润并伴有水肿，部分细胞出现坏死现象，肾小球呈现明显扩张状态，甚至出现坏死溶解，髓质部分血管扩张充血严重；GS 组皮质部分观察到少许炎细胞浸润，肾小囊内伴有少量充血，髓质部分可见少量毛细血管扩张出血严重，见图3.

图3 大鼠肾脏HE 染色病理切片（×200）

2.8 对肾脏中TGF-β1的阳性表达的影响

TGF-β1的阳性表达呈现棕黄色颗粒，黄染程度越深，面积越大，表明阳性表达越高.在肾脏髓质部分和皮质部分，与KB 组相比，LS 组和GS 组的黄染程度和面积都明显增大（P<0.01），而LS 组较GS 组黄染程度也明显加深（P<0.01）.见图4.

图4 大鼠肾脏中TGF-β1 阳性表达（×200）

2.9 大鼠肾组织Nrf2 和HO-1 蛋白的表达

与KB 组 相 比，LS 组Nrf2 和HO-1 蛋 白 表达水平降低明显（P<0.01），而GS 组降低不明显，见图5.

图5 大鼠Nrf2 和HO-1 蛋白含量表达

3 讨论

中药雷公藤和及己都可用于治疗炎症，但均有一定的肾毒性，同时及己根的毒性较茎和叶小［8］.目前尚未有文献报道及己根和雷公藤水提取物的肾毒性比较研究，因此，及己根和雷公藤的肾毒性大小有待深入研究，以观察及己是否具有进一步的开发价值.

本研究中，大鼠的的体重变化情况和肾脏系数显示，LS 组和GS 组大鼠体重增长和肾脏系数上升均较KB 组低，表明这两组大鼠的肾脏组织皆出现了毒性损伤.而与GS 组相比，LS 组大鼠体重和肾脏系数的变化更为明显.从大鼠肾脏组织HE 染色的病理切片也可以看出，LS 组和GS 组大鼠肾小管皮质部分已经出现了炎细胞，且LS 组的髓质部分扩张出血更为严重，以上结果表明，LS 组大鼠的肾组织受损较重.

作为评价肾功能的常规指标，血清CR 可以准确反应机体肾脏是否出现实质性受损，CR 值偏高，代表肾功能下降［9］.BUN 是衡量肾小球滤过功能的常规指标，当肾脏受损较严重或者受损时间较长时，BUN 数值异常升高［10］.UA 含量与肾功能密切相关，肾损伤时则会应激性升高［11］.当患者的肾功能出现异常时，CR、BUN 和UA 的数值会表现出不同程度的升高.本研究中，GS 组BUN 含量无显著上升，而CR 和UA 含量都极显著性升高，而LS组三个指标均极显著性升高，表明LS 组引起了更为严重的肾毒性，该组大鼠肾损伤更加严重.

氧化应激损伤与肾组织损伤息息相关，当生物体内活性氧（ROS）成分过多，生物体内的氧化与抗氧化系统平衡就会被打破.大量的ROS 会产生具有毒性作用的活性氧分子如羟基自由基和亚硝酸阴离子等［12］.脂质氧化产物MDA 是衡量机体氧化胁迫程度的常用指标之一，过量的MDA 能导致膜脂过氧化，造成细胞膜损伤［13］.SOD 作为机体抗氧化酶，可有效清除O2-，避免细胞损伤，其含量高低可反映机体氧化应激的损伤强度［14］.本研究中LS 组T-SOD 含量的降低幅度和MDA 含量的升高幅度均较GS 组更大，表明LS 组大鼠氧化应激损伤更严重.

TGF-β1广泛参与组织修复和炎症等多种疾病过程，具有促纤维化作用，肾功能衰竭、肾炎和肾纤维化等疾病的发生均伴随TGF-β1水平的升高［15］.TGF-β1还可以促进细胞凋亡和炎症因子的产生，增加炎症反应的发生风险.因此通过抑制TGF-β1的阳性表达可以减轻肾组织的损伤程度［16］.本研究中，LS 组和GS 组TGF-β1阳性表达均上升，LS 组上升最明显，表明LS 组大鼠肾损伤较严重.

Nrf2/HO-1 通路可调节机体因内外环境变化引起的氧化应激反应.Nrf2 能够抑制TGF-β1的表达、调节抗氧化酶的活性，还能激活下游HO-1 的表达.HO-1 存在于组织细胞中，可以清除机体内的氧自由基，防止机体出现氧化损伤［17］.但在毒性作用下，Nrf2 通路的激活受到抑制，导致HO-1 的表达也会相应减少，无法发挥保护效果［18］.本 研 究中，LS 组Nrf2 和HO-1 水平较GS 组下降更为明显，表明LS 组的Nrf2/HO-1 通路被抑制的程度更大，所遭受的毒性损伤也更为严重.

本研究结果初步阐明了雷公藤水提物对大鼠所造成的肾组织损伤比及己根水提取物更为严重的事实，并证实了其肾损伤与Nrf2/HO-1 信号通路以及生物体内的氧化应激可能有关.但本研究并不能确定是否存在其他通路导致了大鼠的肾组织损伤，相关机制还需要进一步探索.

综上所述，LS 组肾毒性大于GS 组，该机制可能为雷公藤水提取物通过诱导氧化应激损伤和抑制Nrf2/HO-1 信号通路导致更为严重的大鼠肾毒性.