MAPK/ERK通过诱导纤维蛋白A磷酸化抑制垂体瘤细胞增殖、凋亡、迁移及相关信号转导

杨延庆，王焕焕*，谢坤霞，李 健

0 引言

垂体瘤是存在于脑垂体中的一种肿瘤，大多数是良性肿瘤，部分会发展成恶性肿瘤[1]。目前，对于垂体瘤的治疗方法，主要包括手术治疗、药物治疗和放射治疗，手术治疗会引起一系列的后遗症和并发症，药物治疗具有一定的局限性，放射治疗对垂体的功能有很大的损伤性[2]。MAPK/ERK通路是多种信号通路的核心，此通路在细胞增殖、细胞凋亡的过程中发挥着重要作用，同时在肿瘤的发生发展中也发挥着重要的作用，已经被作为抗炎、抗癌药物的靶点[3-6]。目前，MAPK/ERK通路在垂体瘤细胞的发生过程中的作用尚未阐明。有报道，纤维蛋白在肿瘤细胞向周围组织浸润以及向远端组织转移的过程中发挥重要作用[7]。吴丹荣等[8]研究发现，在垂体瘤的增殖和迁移中，其作用机制与NF-κB通路的活化有关。

本研究通过SB203580(MAPK/ERK抑制剂)处理垂体瘤细胞后，检测SB203580在垂体瘤细胞纤维蛋白A以及垂体瘤细胞增殖、凋亡、迁移以及NF-κB/MMP-9/VEGF通路中的影响，以期为研究治疗垂体瘤的方法提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 DMEM培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司；Trizol、氯仿购自Takara公司；FastKing RT kit购自北京天根生化公司；0.25%胰酶溶液、PBS溶液、结晶紫溶液、细胞固定液、RIPA强蛋白裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司；CCK-8试剂盒、MAPK/ERK抑制剂(SB203580)、Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天有限公司；CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、细胞纤维蛋白A磷酸化、NF-κB、MMP-9、VEGF、β-actin和山羊抗鼠二抗购自美国Cell Signaling Technology；Transwell小室购自美国Millpore公司；梯度PCR仪、核酸电泳仪、紫外凝胶成像系统购自Bio-Rad公司；细胞培养箱购自Thermo公司；倒置荧光显微镜购自Nikon公司。

1.2 细胞培养 人的垂体瘤细胞株购自北京细胞库(AtT20细胞株)，取出冷冻的细胞，在37 ℃的水浴锅内快速解冻，争取在1 min内完成，离心3 min(1 000 r/min)，在超净台内弃掉细胞上清，用含有血清浓度为10%的DMEM培养基重悬细胞沉淀至25 cm2的细胞培养瓶中，在37 ℃、5% CO2的条件下于培养箱中培养。

1.3 SB203580最佳安全浓度的确定 待垂体瘤细胞长满，用0.25%胰酶溶液消化后，将其接种至96孔细胞培养板中，待垂体瘤细胞密度达到70%～80%，分别加入浓度为10 mmol/L的SB203580，使其最终浓度变成5、15、20、30、40、55、65、80、100、120、140 μmol/L (每个浓度设置3个复孔，同时设置空白对照)，细胞在37 ℃、5% CO2的条件下培养48 h后，加入合适剂量的CCK-8溶液，在培养箱孵育2 h后，在酶标仪中于450 nm波长处测定OD值，进行分析。

1.4 细胞增殖率的检测 确定SB203580最佳安全浓度后，将垂体瘤细胞接种至96孔细胞培养板中，待垂体瘤细胞密度达到70%～80%，加入SB203580，培养48 h后，加入合适剂量的CCK-8溶液，设置空白细胞作对照，在培养箱孵育2 h后，在酶标仪中于450 nm波长处测定OD值，分析细胞的增殖情况。

1.5 流式细胞术检测垂体瘤细胞的凋亡 待垂体瘤细胞密度达到70%～80%，加入SB203580，设置空白细胞作对照，在37 ℃、5% CO2的条件下培养48 h后，弃掉上清，0.25%胰酶溶液消化细胞后用PBS收集细胞悬液，800 r/min离心3 min弃掉上清，用预冷的PBS洗涤细胞2次，重新收集细胞沉淀，加入适量的1×Binding buffer将细胞数目调至1×106个/ml，取上述适量的细胞悬液(包含细胞数目为1×105个/ml)，加入200 μl Annexin V-PE结合液轻轻重悬细胞，混匀后避光孵育20 min，置于冰浴中，最后进行流式细胞仪检测。

1.6 RT-PCR检测CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax mRNA的表达 待垂体瘤细胞密度达到70%～80%，加入SB203580，设置空白细胞作对照，在37 ℃、5% CO2的条件下培养48 h后，弃掉上清，0.25%胰酶消化细胞后收集细胞沉淀，加入Trizol裂解细胞沉淀，提取细胞的总RNA，用FastKing cDNA第一链合成试剂盒反转录得到cDNA，以此为模板，β-actin作内参，通过RT-PCR检测不同样品中CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax mRNA的表达情况。反应体系包括cDNA 0.4 μl，2×Fast qPCR Master Mixture(Green) 10 μl，上下游引物各0.4 μl，ddH2O 3.8 μl。反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，进行40个循环。扩增结果采用2-△△Ct法计算。引物序列见表1。

表1 RT-PCR的定量引物

1.7 Western blot检测CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、纤维蛋白A的磷酸化水平以及NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表达 待垂体瘤细胞密度达到70%～80%，加入SB203580，设置空白细胞作对照，在37 ℃、5% CO2的条件下培养48 h后，弃掉上清，收集细胞沉淀，加入RIPA裂解液(含有PMSF)裂解细胞蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，具体操作步骤根据说明书进行。在蛋白样品中加入5×loading buffer于沸水中煮沸10 min后，取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，将CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、caspase3、纤维蛋白A的磷酸化、NF-κB、MMP-9、VEGF的抗体(1∶2 000)作为一抗进行过夜4 ℃孵育，用TBST洗膜5 min，洗3次后，用HRP标记的山羊抗鼠二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，用TBST洗膜5 min，洗3次后，加入ECL显色液，于凝胶成像仪中曝光拍照。

1.8 细胞迁移能力检测 待垂体瘤细胞密度达到70%～80%，加入SB203580，设置空白细胞作对照，在37 ℃、5% CO2的条件下培养48 h后，弃掉上清，收集不同处理的细胞沉淀，用空的DMEM培养基重悬细胞沉淀，使其细胞数目变成1×103个/ml，向包含基质胶的TranswellTM上室中接种100 μl左右的细胞悬液，上下室中加入1 ml含有血清浓度为10%的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2的条件下培养24 h后，取出Transwell，甲醛固定20 min后，用结晶紫染色20 min后，PBS洗涤3次，最后于显微镜下进行拍照和计数。

2 结果

2.1 SB203580最佳安全浓度的确定及SB203580抑制垂体瘤细胞中纤维蛋白A的磷酸化 CCK-8法确定SB203580的最佳安全浓度。结果显示，当SB203580浓度为55 μmol/L时，细胞的活性和空细胞的活性接近，最后确定SB203580的使用浓度为55 μmol/L(图1A)。通过Western blot实验检测SB203580处理垂体瘤细胞后，纤维蛋白A的磷酸化水平，结果显示，SB203580组和空白组相比较，纤维蛋白A的磷酸化水平显著下降(图1B)，表明MAPK/ERK能够诱导垂体瘤细胞的纤维蛋白A的磷酸化。

图1 SB203580对纤维蛋白A磷酸化水平的影响注：A.CCK-8法检测SB203580的最佳浓度；B.Western blot检测SB203580组细胞中纤维蛋白A磷酸化的表达水平

2.2 SB203580促进垂体瘤细胞的增殖 CCK-8法检测垂体瘤细胞的增殖情况。结果显示，SB203580组细胞增殖情况显著高于空白组(P<0.01)，见图1。RT-PCR和Western blot实验结果显示，SB203580组垂体瘤细胞中CyclinD1、CyclinE1 mRNA和蛋白的表达量显著高于空白组(P<0.01)，p21 mRNA和蛋白的表达量显著低于空白组(P<0.01)。见图2。

图2 SB203580对垂体瘤细胞增殖的影响注：A.CCK-8法检测SB203580对垂体瘤细胞增殖的影响；B.RT-PCR检测CyclinD1、CyclinE1、p21 mRNA相对表达量；C.Western blot检测CyclinD1、CyclinE1、p21蛋白表达。***与空白组比较，P<0.01

2.3 SB203580促进垂体瘤细胞的凋亡 SB203580处理细胞后，首先通过流式细胞术检测垂体瘤细胞的凋亡百分数，结果显示，SB203580组细胞凋亡百分数显著高于空白组(P<0.01)。RT-PCR和Western blot实验结果显示，SB203580组垂体瘤细胞中Bcl-2 mRNA和蛋白的表达量显著低于空白组(P<0.001)，Bax mRNA和蛋白的表达量显著高于空白组(P<0.01)。见图3。

图3 SB203580对垂体瘤细胞凋亡的影响注：A～B.流式细胞术检测SB203580对垂体瘤细胞凋亡的影响；C.RT-PCR检测SB203580组细胞凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的相对表达量；D.Western blot检测SB203580组细胞凋亡因子Bcl-2、Bax蛋白的表达。与空白组比较，***P<0.01

2.4 SB203580促进垂体瘤细胞的迁移 TranswellTM实验检测结果显示，与空白组相比较，SB203580组细胞迁移情况和细胞迁移数显著高于空白组(P<0.01)，见图4。

图4 TranswellTM迁移实验检测SB203580对垂体瘤细胞的影响注：***与空白组比较，P<0.001

2.5 SB203580促进垂体瘤细胞NF-κB/MMP-9/VEGF通路的发生 Western blot实验结果显示，SB203580组垂体瘤细胞中NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表达量显著高于空白组，见图5。

图5 SB203580对垂体瘤细胞NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白表达的影响

3 讨论

垂体瘤是一种从垂体前叶和后叶及颅咽管上皮残余细胞发生的肿瘤，垂体瘤通常发生于30岁左右，严重影响患者的日常生活能力[9]。探究能够抑制垂体瘤细胞增殖能力以及细胞迁移能力的关键蛋白及研究促进垂体瘤细胞凋亡的机制是目前研究的焦点。

MAPK/ERK信号通路是肿瘤发生中重要的基因信号转导通路，此通路与肿瘤细胞的增殖以及凋亡等过程密切相关[10]。有研究报道，MAPK/ERK相关抑制剂与一些肿瘤化学治疗药品相联合，能够对肿瘤细胞达到一定的抑制作用，增加肿瘤细胞对药物的敏感性，还可以减少药物的毒性，最终减少对患者身体的损伤[11]。因此，本研究首先通过CCK-8法确定了SB203580的最佳安全使用浓度，然后用适宜浓度的SB203580处理垂体瘤细胞后，通过Western blot检测到垂体瘤细胞中纤维蛋白A的磷酸化水平下降，说明MAPK/ERK能够诱导纤维蛋白A的磷酸化，参与垂体瘤细胞的发生发展过程。其次，通过CCK-8检测SB203580处理垂体瘤细胞后细胞的增殖情况，发现抑制MAPK/ERK通路后，细胞的增殖能力升高，同时，通过RT-PCR、Western blot检测细胞增殖的一些关键因子的表达，发现促进细胞增殖的蛋白CycinD1和CycinE1表达升高，抑制细胞增殖的蛋白p21表达下降，说明MAPK/ERK能够抑制垂体瘤细胞的增殖。最后研究了MAPK/ERK对垂体瘤细胞凋亡和迁移的影响，抑制MAPK/ERK通路后，流式细胞术发现细胞凋亡数增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降，促凋亡蛋白Bax的表达升高，细胞的迁移能力升高，说明MAPK/ERK能够抑制垂体瘤细胞的凋亡和迁移。因此，可以确定MAPK/ERK通过诱导纤维蛋白A的磷酸化抑制垂体瘤细胞的增殖、凋亡和迁移。

为了进一步研究MAPK/ERK抑制垂体瘤细胞增殖的相关机制，本研究选择了NF-κB/MMP-9/VEGF通路进行研究，将SB203580处理垂体瘤细胞后，通过Western blot检测到SB203580组中3个蛋白的表达量明显高于空白组。有研究表明，此通路在肿瘤细胞增殖过程中发挥重要的作用[12-13]，说明MAPK/ERK能够抑制NF-κB/MMP-9/VEGF通路的发生，最后抑制垂体瘤细胞的增殖，与本研究结果一致。

以上结果为研制能抑制垂体瘤细胞侵袭与发生的新的药物提供了一定的思路，为进一步探究垂体瘤的发生发展机制提供了理论基础。