人参多糖对脂多糖刺激小鼠巨噬细胞的免疫调控作用
2021-03-01陈广勇韩乾杰张玲玲杨彩梅
陈广勇,韩乾杰,张玲玲,李 慧,杨彩梅,*
(1.浙江农林大学动物科技学院·动物医学院,浙江省畜禽绿色生态健康养殖技术研究重点实验室,动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室,浙江杭州 311300;2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司,浙江安吉 311703)
植物多糖是从天然植物中提取的生物高分子活性物质,具有调节动物机体免疫、抑菌抗病毒和恢复其肠道上皮细胞的活力等作用[1]。人参多糖(Ginseng Polysaccharide,GPS)是人参根茎提取人参皂甙后剩余部分中提炼而来,对于患有轮状病毒的小鼠,GPS 能够减轻其症状,且使受到损伤肠道上皮恢复正常功能[2]。饲粮中添加植物多糖能改善断奶仔猪的生长速度,增强细胞免疫和体液免疫功能和Thl 类细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2 类细胞因子的分泌量,逆转免疫抑制[3]。GPS 可以改善大鼠抗生素相关腹泻结肠组织结构变化并且改善炎性肠病结肠损伤,改善硫酸葡聚糖钠(DextranSulphate Sodium,DSS)造成的结肠炎性水平[4]。GPS能够改善创伤性脓毒症患者的免疫功能,抑制或减轻炎性反应[5]。目前,GPS 对于抗炎和免疫调节的影响虽有一定研究,但关于在应激条件下GPS 对细胞及免疫调节相关信号通路的作用机理尚不清楚。本试验旨在研究在LPS 刺激条件下,GPS 对应激小鼠巨噬细胞形态及免疫功能的影响,为GPS 在免疫调节和缓解炎症方面的作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 GPS 市购,含量90%,其余10% 为辅料麦芽糊精,主要由葡萄糖、果糖和甘露聚糖等组成;细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS,来源于大肠杆菌,血清型O55:B5)购自于美国Sigma 公司。小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。
酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)、白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。
1.2 RAW264.7 细胞培养 参考许丹等[6]方法,培养RAW264.7 细胞,进行计数并观察细胞形态。
1.3 LPS 诱导RAW264.7 细胞炎症模型的建立 根据李淑玲[7]的研究进行LPS 浓度范围探索,分别配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μg/mL LPS 溶液,分别刺激RAW264.7 细胞,在37℃、5% CO2条件下培养24 h,每个组别设置6 个重复,试验终剂量为500 μL。观察细胞形态记录细胞数量,并且检测其LDH 活性,随着LPS 浓度升高到1.0 μg/mL,LDH 不发生明显变化,因此选取1.0 μg/mL LPS 浓度用于RAW264.7 细胞炎症模型。
1.4 GPS 对RAW264.7 细胞形态的影响 试验设置1 个CON 组(对照组)及LPS 组(1 μg/mL LPS);GPS 组(1 μg/mL LPS+1 mg/mL GPS)2 个试验组,每组6 个重复。各组均使用无抗细胞培养液培养。LPS 组和GPS 组加250 μL 的LPS 刺激培养1 h 后,再添加250 μL GPS溶液,空白对照组添加等量细胞处理液,置于37℃、5%CO2培养箱培养24 h。观察细胞形态并进行显微拍照。
1.5 GPS 对细胞生物酶活性和细胞促炎症因子分泌功能的影响 试验分为CON 组(对照组)、LPS 组(1 μg/mL LPS)、1 mg/mL GPS 组(1 μg/mL LPS+1 mg/mL GPS)、0.5 mg/mL GPS 组(1 μg/mL LPS+0.5 mg/mL GPS)、0.1 mg/mL GPS 组(1 μg/mL LPS+0.1 mg/mL GPS)5 个组,每组6 个重复。LPS 组、1 mg/mL GPS组、0.5 mg/mL GPS 组和0.1 mg/mL GPS 组添加250 μL的LPS 刺激培养1 h 后,GPS 组分别添加250 μL 不同浓度的GPS 溶液,CON 组和LPS 组添加细胞处理液至500 μL,于37℃、5% CO2培养箱分别培养12、24、48 h。取细胞上清液,检测LDH、AKP、ACP、TNF-α、IL-1β含量。
1.6 GPS 对炎症细胞TLR4 信号通路基因表达量的影响试验分为4 个组,每组6 个重复。CON(对照组)采用500 μL 细胞培养液处理24 h,不采用LPS 刺激;GPS对照组采用500 μL 浓度为1 mg/mL 的GPS 培养液处理24 h;LPS 组采用250 μL 浓度为1 μg/mL 的LPS 刺激1 h,再添加250 μL 细胞培养液培养23 h。参考戴先成等[8]的方法,用实时定量RT-PCR 方法测定TLR-4、NFκB、MyD88的mRNA 水平。参考韩乾杰[9]的方法,设计引物序列如表1,由杭州尚亚生物科技有限公司合成和验证。
表1 实时荧光定量PCR 引物
1.7 统计分析 数据采用SPSS 21.0 软件进行统计分析,使用单因子方差分析(One-Way ANOVA,LSD),以P<0.05 表示差异显著。
2 结果
2.1 GPS 对LPS 刺激巨噬细胞形态的影响 由图1 可见,在培养1 h 后,LPS 刺激组培养1 h 后RAW264.7细胞较轻程度的变形。在培养24 h 后,CON 组的RAW264.7 细胞形态与1 h 前无显著差异,均为椭球状且24 h 后增殖能力良好;LPS 组细胞数量显著降低,细胞形态不规则,细胞膜破损导致细胞液外泄。LPS 刺激后添加GPS,细胞形态、细胞增殖能力恢复至正常水平,与未添加GPS 差异显著。
图1 GPS 对LPS 刺激巨噬细胞形态的影响
2.2 GPS 对LPS 刺激巨噬细胞生物酶活性的影响 由表2 可得,LPS 处理后12、24、48 h,LPS 组的LDH 值均显著高于空白对照组。与LPS 组相比,添加GPS 后LDH 值均显著降低。
LPS 处理后的RAW264.7 细胞ACP 活性在12、24、48 h 均低于对照组(P<0.05)。添加GPS 能够提高巨噬细胞ACP 活性(P<0.05)。LPS 诱导刺激后的RAW264.7 细胞分泌AKP 含量在12、24 h 均显著低于对照组。高剂量GPS 组在12、24、48 h AKP 含量均高于LPS 组和对照组(P<0.05)。
2.3 GPS 对LPS 刺激巨噬细胞炎症因子分泌的影响 由表3 可知,RAW264.7 细胞在LPS 刺激下分泌的IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05),在48 h 内持续升高。GPS 能够降低RAW264.7 受到LPS 刺激分泌促炎症因子IL-1β和TNF-α的水平(P<0.05)。相同时间内,GPS 浓度越高,促炎症因子降低越显著。
2.4 GPS 对LPS 刺激巨噬细胞TLR4 信号通路相关基因的影响 由表4 可知,当给予LPS 诱导刺激后,RAW 264.7 细 胞TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA 表达量相较于对照组显著升高。添加GPS mRNA 表达量均较LPS 组显著降低。
表3 GPS 对LPS 刺激巨噬细胞炎症因子含量的影响 ng/L
表4 GPS 对LPS 刺激巨噬细胞信号通路相关基因mRNA 表达量的影响
3 讨 论
巨噬细胞属免疫细胞,通过非特异性识别抗原物质,对病原体进行吞噬作用,诱导免疫应激,产生抗原递呈,从而激活机体的免疫系统,实现免疫细胞对抗原分子识别、活化、增殖和分化,启动免疫应答[10]。
LPS 是一个由类脂A 和纤维素构成的生物大分子,其中类脂A 是LPS 的毒性和生物活性中心,它由2 个葡萄胺、磷酸盐和一定量的脂肪酸构成,其分子量在10 000 以上[11]。LPS 是革兰氏阴性菌细胞壁特有的化学成分,是一种免疫激活剂,作用于动物细胞时会表现炎症反应[12]。正常情况下巨噬细胞可以通过各种刺激从静息状态到免疫反应激活[13]。任琳等[14]研究表明,LPS 刺激巨噬细胞,诱导其分泌大量的炎症因子,过量的炎症因子会加速巨噬细胞的非程序性死亡,引起免疫应激。多糖对机体的免疫调控作用主要为激活巨噬细胞、激活网状内皮细胞、激活T 细胞和B 细胞、激活补体、促进干扰素的生成、促进白细胞介素的生成等[15-16]。
Xu 等[17]研究发现黄芪多糖纳米颗粒对LPS 处理的H9c2 细胞形态起到保护作用。本研究发现当用LPS刺激单核巨噬细胞后,巨噬细胞会发生形态的改变;添加GPS 可直接作用于免疫细胞,修复细胞的形态,细胞恢复卵圆形,改善细胞膜破损,减少细胞液外溢,可显著发挥抗炎作用。
LDH 是巨噬细胞活化的标志之一,它对巨噬细胞的吞噬作用有直接影响,吞噬过程需要糖酵解的能量,而激活LDH 可以加速糖酵解过程[18]。李异等[19]以LPS 刺激新生大鼠心肌细胞,发现LPS 能降低心肌细胞存活率,促进LDH 释放,表明LPS 刺激导致了心肌细胞损伤,LDH 含量升高表明细胞损伤程度增大。尹俊等[20]试验发现柴胡多糖可呈浓度依赖性增强细胞活力,LDH 含量显著降低,说明柴胡多糖对心肌损伤具有保护作用。本研究发现GPS 显著降低由于LPS 诱导产生的LDH,对于LPS 刺激的RAW264.7 形态改变细胞膜破损有较好的改善效果。
ACP 和 AKP 是2 种重要的机体功能调节酶,ACP广泛分布于生物界,是一种磷酸酯酶,大量研究表明磷酸酶活力是细胞和体液免疫的综合体现,也是衡量免疫功能和机体状态的指标,反映了机体对外源微生物侵染的防御能力[21]。Millar 等[22]研究发现,在蛋白(酶)的去磷酸化过程中,ACP 和 AKP 可能共同参与了细胞的增殖启动。本研究发现APS 能够提高ACP 和AKP的活性,增强了巨噬细胞对外源微生物侵染的防御能力。
由于巨噬细胞拥有Toll 样受体和清道夫受体,它们对凝集素、脂蛋白、蛋白质、寡核苷酸、多糖和其他分子具有广泛的配体特异性。另一方面,巨噬细胞在其膜上表达主要的组织相容性复合物(MHC)II 类分子,因此也向淋巴细胞呈递抗原。所以巨噬细胞是最早与这些入侵者接触的一些细胞,启动针对微生物的免疫反应。研究表明诱导免疫细胞分泌多种细胞因子的基因转录的关键信号通路为TLR4/NF-κB[23]。Kim 等[25]研究发现,与免疫抑制剂环磷酰胺治疗组相比,刺松藻和红参提取物混合物大大增加了iNOS、COX-2、TLR-4、IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ等免疫相关基因的表达。本研究发现,LPS 刺激后TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的转录量明显上升,启动免疫应激,而添加GPS 能缓解免疫应激,降低TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的转录量。
Evgenikos 等[26]研究发现,TLR4的转录受到来自IL-1β正反馈,促炎症因子被免疫细胞大量分泌,炎症反应开始加剧,中性粒细胞和白细胞同时作用于肠道,加剧炎症反应。Wu 等[27]研究发现,由LPS 刺激后巨噬细胞后,添加平菇多糖能够显著降低LDH、IL-1β和TNF-α水平,降低免疫应激。TNF-α是巨噬细胞应激时产生的小分子蛋白,具有炎症介质作用。IL-1β和TNF-α水平伴随炎症反应加剧不断升高,可以用来判断炎症反应程度。Spielmann 等[28]研究发现,患有溃疡性结肠炎患者血清中的TNF-α含量升高。Caillot 等[29]研究发现LPS 处理巨噬细胞诱导NF-κB 表达显著上升,黑莓多糖能够显著降低其表达,并且减少TNF-α和IL-1β分泌。本试验发现,LPS 刺激巨噬细胞,促进TNF-α和IL-1β的分泌增加,导致炎症反应加剧,GPS 通过降低TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的转录量从而减少免疫相关基因促炎症因子 IL-1β和TNF-α水平,减少炎症反应,缓解过量应激给机体带来的损伤。
4 结 论
本研究结果显示,添加GPS 可以改善LPS 刺激的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的细胞形态,恢复细胞增殖;提高ACP 和AKP 活性;减少TLR4、MyD88和NF-κB基因的转录,抑制促炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌及表达,降低免疫应激。