2019—2020年上海地区儿童幽门螺杆菌感染及其耐药性分析

李春玲，何磊燕，付盼，陈赛阁，王爱敏，张蕾，王传清

复旦大学附属儿科医院，上海 201102

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一种定植在胃黏膜表层的革兰氏阴性微需氧菌，被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)定为Ⅰ类致癌物，全球约有一半人口感染[1]。儿童幽门螺杆菌感染往往发生在儿童早期，与慢性胃病及消化性溃疡的发生有关，多数患儿发展成慢性浅表性胃炎，无明显临床症状，少数发展成十二指肠溃疡[2]。有研究认为儿童感染幽门螺杆菌可能出现生长发育不良等问题[3-5]。目前，在幽门螺杆菌根除治疗方案中，临床常用胃三联或四联疗法，用于儿童幽门螺杆菌感染根除治疗的抗菌药物有甲硝唑、克拉霉素及阿莫西林。然而，随着近年来抗菌药物的广泛使用，儿童感染幽门螺杆菌的耐药问题日益加重。

本研究以2019—2020年于复旦大学附属儿科医院就诊的幽门螺杆菌感染患儿为研究对象，回顾性分析分离的幽门螺杆菌对甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星的敏感性，监测上海地区儿童感染幽门螺杆菌的耐药状况，从而为临床根治幽门螺杆菌过程中合理使用抗菌药物提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

主要材料包括哥伦比亚平板(含5%绵羊血)(法国生物梅里埃公司)、微需氧产气袋(上海科马嘉微生物技术有限公司)、羊血M-H培养基(上海伊华生物科技有限公司)、E-test试纸条(温州市泰康生物科技有限公司)、MALDI-TOF生物质谱仪(法国生物梅里埃公司)。

1.2 幽门螺杆菌的分离培养及鉴定

收集2019年1月—2020年10月于复旦大学附属儿科医院行胃镜检查的1 605例患儿的胃黏膜组织标本各1块(小米粒大小)，于0.5 mL布氏肉汤中研磨成匀浆，接种于哥伦比亚平板，迅速置于微需氧环境(5% O2、10% CO2和85% N2)中37 ℃培养3～6 d，观察菌落形态。取半透明且细小的菌落行革兰染色镜检(弯曲状、海鸥状的短小阴性杆菌)、尿素酶试验(阳性)、触酶试验(阳性)、氧化酶试验(阳性)、硝酸盐还原试验(阴性)及MALDI-TOF生物质谱仪分析，确证为幽门螺杆菌。

1.3 体外药敏试验

用无菌棉签取幽门螺杆菌菌落，配制2麦氏浊度的菌悬液，再用棉签均匀涂布于含5%绵羊血的M-H培养基，将甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星E-test试纸条置于平板，迅速置于37 ℃微需氧环境(5% O2、10% CO2和85% N2)培养3 d，读取药敏结果。判读标准根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2019版及欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)标准[6-7]制定，阿莫西林、左氧氟沙星、克拉霉素和甲硝唑的耐药折点分别为>0.125 mg/mL、>1 mg/mL、>0.5 mg/mL、>8 mg/mL。质控菌株为幽门螺杆菌标准菌株ATCC 43504。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析，耐药率比较采用χ2检验，理论频数小于1时，采用Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 幽门螺杆菌的分离率

从本研究入组的 1 605 份患儿胃黏膜标本中共分离出幽门螺杆菌506株，总阳性率为31.5%，其中2019年、 2020年幽门螺杆菌培养阳性率分别为30.8%(356/1 155)、33.3%(150/450)。男性患儿的幽门螺杆菌培养阳性率为31.5%(287/910)，女性患儿为31.5% (219/695)，无统计学差异(χ2= 0.00，P=0.99)。将患儿按学龄分成4组：1～3岁(学前阶段)、4～6岁(幼儿园阶段)、7～12(小学阶段)、13～16(中学阶段)，各组幽门螺杆菌培养阳性率分别为25.0% (15/60)、29.0%(114/393)、32.1%(300/934)、35.3%(77/218)，无统计学差异(χ2=3.945，P=0.267，见表1)。

表1 不同年龄患儿的幽门螺杆菌阳性率

2.2 幽门螺杆菌对4种抗菌药物的耐药率

幽门螺杆菌对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林的总体耐药率分别为42.3%、25.1%、8.1%、3.0%，对甲硝唑和克拉霉素的耐药率明显高于左氧氟沙星和阿莫西林(χ2=306.192，P<0.01，见表2)。

表2 幽门螺杆菌对4种抗菌药物的敏感性 [n(%)]

2.3 影响幽门螺杆菌耐药率的因素

2.3.1 幽门螺杆菌耐药率与患儿性别的关系幽门螺杆菌对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星和阿莫西林的耐药率在男、女患儿之间均无统计学差异(见表3)。

表3 男、女患儿的幽门螺杆菌对4种抗菌药物的耐药率 [n(%)]

2.3.2 幽门螺杆菌耐药率与患儿年龄的关系幽门螺杆菌对阿莫西林、左氧氟沙星和甲硝唑的耐药率在各年龄段患儿之间无统计学差异(分别为χ2=2.506，P=0.474；χ2=1.532，P=0.675；χ2=2.854，P=0.46)。但值得注意的是，4组患儿对克拉霉素的耐药率分别为13.3%、21.1%、25.7%、31.2%，其中13～16岁患儿对克拉霉素的耐药率显著高于1～3岁患儿(P=0.040，见表4)。

表4 幽门螺杆菌耐药率与患儿年龄的关系[n(%)]

2.4 幽门螺杆菌双重耐药及多重耐药分析

本研究分离到的506株幽门螺杆菌中，203株对4种抗生素均敏感，占40.1%。进行双重耐药和多重耐药分析，发现双重耐药有5种情况：克拉霉素+甲硝唑、克拉霉素+左氧氟沙星、甲硝唑+左氧氟沙星、甲硝唑+阿莫西林、阿莫西林+左氧氟沙星，耐药率分别为18.0%、5.1%、4.9%、1.4%、0.8%，其中对克拉霉素+甲硝唑的耐药率显著高于其他4种情况(χ2=172.706，P<0.01)。三重耐药分析显示，幽门螺杆菌对左氧氟沙星+克拉霉素+甲硝唑的耐药率为3.0%，显著高于对左氧氟沙星+阿莫西林+克拉霉素(0.6%)和阿莫西林+甲硝唑+左氧氟沙星(0.6%)的耐药率(χ2=13.907，P=0.01)。此外，有2例患儿从其中分离的幽门螺杆菌对4种抗菌药物全耐药(见表5)。

表5 幽门螺杆菌的双重耐药及多重耐药分析 [n(%)]

3 讨论

幽门螺杆菌感染是儿童消化道溃疡、慢性活动性胃炎等疾病发生的重要诱因[2, 8]，可影响儿童生长发育及学习[9]。有研究表明，幽门螺杆菌感染与口腔疾病的发生及胃内微生态改变具有相关性[10-12]。5岁以下儿童幽门螺杆菌感染率在发达国家约为20%，而在许多发展中国家高达50%[13]，因此控制儿童期幽门螺杆菌感染对儿童健康成长及成人胃癌等疾病的预防具有重要意义。

常用的根除幽门螺杆菌的抗菌药物有硝基咪唑类、β-内酰胺类、大环内酯类、喹诺酮类等，但近年来其对抗菌药物的耐药性逐渐增强，根除率呈下降趋势[14]。本研究将入组患儿按学龄分成4组，即1～3岁组(学前阶段)、4～6岁组(幼儿园阶段)、7～12岁组(小学阶段)和13～16岁组(中学阶段)，各组幽门螺杆菌培养阳性率分别为25.0%(15/60)、29.0%(114/393)、32.1%(300/934)和35.3%(77/218)，各组之间无统计学差异。而黄洁等[15]采用C尿素呼气试验对上海市闵行区 1 988 名7～18岁中小学生进行调查分析，发现幽门螺杆菌感染率随年龄增长呈上升趋势，小学、初中、高中组感染率分别为27.4%、33.6%、45.1%。

甲硝唑属于硝基咪唑类抗菌药物，曾被推荐为根除幽门螺杆菌的首选药物，但近年来其全球耐药率逐渐升高，尤其是在发展中国家(全球耐药率为20%～95%)[16]。国内报道儿童幽门螺杆菌对甲硝唑的耐药率也较高，为34.4%～75.2%[7, 14, 17-19]。本研究分离的幽门螺杆菌对甲硝唑和克拉霉素的耐药率(42.3%、25.1%)明显高于对左氧氟沙星和阿莫西林的耐药率(8.1%、3.0%)(χ2=306.192，P<0.01)。

克拉霉素属于大环内酯类抗菌药物，全球不同地区幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率为0～86%[16]，差异较大。Dore等[20]研究发现，当幽门螺杆菌对克拉霉素耐药时，其根除率降低55%。本研究中儿童幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率为25.1%，北京的一项研究报道高达93.3%[18]，而南昌、杭州、贵阳分别为13.3%、20.6%、19.35%[14, 17, 21]，可见地区差异很大，因此各地区应做好本地幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率基线调查，从而制定合理的根治方案。Maastricht V共识指出，幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率高于15%～20%及对甲硝唑耐药率高于40%的地区，不推荐经验性使用这两种抗菌药物用于幽门螺杆菌根治方案，建议先行耐药试验[22]。

阿莫西林属于半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗菌药物，幽门螺杆菌对阿莫西林的总体耐药率在全球差异较大：发达国家较低，而发展中国家相对较高，其中印度高达72.5%[23]。我国将阿莫西林用于根治幽门螺杆菌已有二十多年，耐药率未显著增加。已报道我国儿童幽门螺杆菌对阿莫西林的耐药率较低(0～5%)[7, 14, 17-18, 21, 24]，本研究为3%，与国内整体水平一致，因此推荐阿莫西林作为儿童幽门螺杆菌治疗的首选药物之一。

左氧氟沙星为广谱氟喹诺酮类抗菌药物，幽门螺杆菌对其的耐药率在全球范围内普遍较低(<20%)，但近年来有升高趋势。我国儿童幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药率较低(5%～17.6%)，可能与我国要求18岁以下儿童慎用氟喹诺酮类药物有关[24]。

本研究未发现儿童幽门螺杆菌对甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林的耐药率与性别及年龄相关，与Li等[7]、李东丹等[18]的研究结果一致。但幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率在4个年龄段患儿中分别为13.3%、21.1%、25.7%、31.2%，有随年龄增长而升高的趋势，其中13～16岁患儿显著高于1～3岁患儿 (P=0.040)。这可能是由于大环内酯类为儿童呼吸道感染治疗的常用药物，而学龄儿童在校期间发生呼吸道感染的概率较高，有研究揭示既往使用过大环内酯类药物的患者对克拉霉素的耐药风险增加，从而降低了含克拉霉素的三联疗法对幽门螺杆菌的根除率[25]。

对本研究分离的506株幽门螺杆菌进行双重及多重耐药分析，结果显示其对克拉霉素+甲硝唑的耐药率最高，达18.0%，三重耐药中最多的是对左氧氟沙星+克拉霉素+甲硝唑耐药(15株，3.0%)。但北京的一项研究显示，儿童幽门螺杆菌对甲硝唑和克拉霉素的双重耐药率高达52.30%，远远高于杭州地区(11.7%)、江西地区(12.4%)及本研究[14, 17]。此外，本研究发现2例患儿的幽门螺杆菌对4种抗菌药物均耐药。

尽管全世界儿童幽门螺杆菌感染率有降低趋势，但耐药问题依然非常严峻，尤其是对甲硝唑、克拉霉素的耐药率较高。虽然其对左氧氟沙星的耐药率较低，但左氧氟沙星不适用于儿童。提示临床制定幽门螺杆菌治疗方案时，应充分了解患儿既往用药史，推荐先做抗菌药物耐药试验并根据药敏试验结果制定个体化治疗方案，规范、合理使用抗菌药物，减少耐药发生。与此同时，研究者应当集思广益，探索更多幽门螺杆菌的非抗生素疗法，如益生菌、抗菌肽、中医及纳米技术等，从而为提高幽门螺杆菌根除率提供新的思路和依据。