基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析藜芦中化学成分*

贾晓华 ，王维 ，高梦园 ，欧阳慧子 ，何俊

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 301617；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

藜芦为百合科植物黑藜芦（Veratrum nigrum L.）的干燥根及根茎[1]，味苦且辛，性平，有毒，具有催吐、泻下、祛痰、杀虫等功效，主产于中国贵州、河南、河北、山东、山西、陕西、甘肃、内蒙古自治区、湖北、四川和东北等地[2-3]。

藜芦中化学成分复杂，包括生物碱类、黄酮类、二萜类、茋类等[4]，其中藜芦甾体生物碱在藜芦中数量最多，含量最高，为主要成分。据文献报道，藜芦生物碱既是其有毒成分也是有效成分，它可造成小鼠脑部脱氧核糖核酸（DNA）损伤[5]，引起急性毒性并作用于中枢神经系统[6]，但也具有降低血压、强心、抗真菌、抗血栓、抗氧化等药理作用[7]。鉴于其良好的药理作用，藜芦在食品添加剂、保健品、医药和化妆品等领域的应用也越发广泛[8]。目前对藜芦的研究主要集中在化学成分分离和药理作用等方面[8]，对藜芦药材中化学成分分析研究较少[9]。

超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）具有高灵敏度、高选择性、高精密度、高信息采集速度等特点，已成为研究中药复杂化学成分及其定性分析的重要工具[10]。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对藜芦中的化学成分进行定性分析，通过与Metlin数据库及对照品比对，结合化合物准分子离子、碎片离子峰信息及相关文献，共初步鉴定出47个化学成分，为研究藜芦的有效成分及完善其质量标准提供了理论依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司），AgilentQ-TOF 6520质谱仪（美国Agilent公司），Agilent MassHunter分析软件（美国Agilent公司），Milli-Q IQ 7005超纯水制备仪（Millipore公司），5424R型高速离心机（德国Eppendorf公司），AS 60/220.R2型十万分之一天平（波兰RADWAG公司），G3KT18273型旋涡混合器（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试药 对照品：环巴胺（批号：DST190314-087）、芥芬胺（批号：DST190407-087）、藜芦胺（批号：DST190108-024）、槲皮素（批号：DST180521-028）、白藜芦醇（批号：DST190311-045）、藜芦定（批号：2-ALI-112-1）均购自成都曼斯特生物科技有限公司，藜芦托素（批号：CHB-L-153）购自成都克洛玛生物科技有限公司。甲酸（色谱纯）购自美国ROE公司，乙腈（色谱级）、甲醇（色谱级）均购自Merck公司（美国）。藜芦药材，购自安徽亳州药材市场，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为百合科植物黑藜芦（Veratrum nigrum L.）的干燥根。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：CORTECS UPLC C18柱（2.1mm×100mm，1.6μm）；流动相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈；梯度洗脱，洗脱梯度为：0～16min，5%～26%B；16～19 min，26%～27%B；19～33 min，27%～42.5%B；33～37 min，42.5%～60%B；37～40 min，60%～70%B；40～42 min，70%～85%B；42～45 min，85%～95%B；流速：0.3 mL/min；进样体积：3 μL；柱温：40 ℃。

2.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源，正、负离子模式监测；毛细管温度350°C；雾化器压力40 psi；碰撞能量30 V；干燥气流速11 L/min；碎裂电压135 V。

2.3 对照品溶液制备 精密称取对照品藜芦托素、芥芬胺、环巴胺、藜芦胺、槲皮素、白藜芦醇、藜芦定各1 mg加甲醇定容至10 mL，配制成100 μg/mL的对照品溶液。将对照品溶液均置于4℃冰箱储存备用。

2.4 供试品溶液的制备 将藜芦粉碎过2号筛，称取10 g藜芦粗粉，加入150 mL 70%乙醇，回流提取3次，每次2 h，合并滤液，放置室温，补足失重量。取上清液用0.45 μm有机微孔滤膜过滤即得，将储备液放在4°C冰箱储存备用。

3 结果与分析

将藜芦供试品溶液和混合对照品溶液按“2.1”和“2.2”项下的色谱和质谱条件进行UPLC-QTOF-MS/MS分析，分别采集正、负离子模式下的基峰离子流色谱（BPC）图，见图1。用Agilent Masshunter Qualitative Analysis分析软件对正、负离子模式下采集的藜芦提取物BPC图进行提取，根据分子离子碎片，确定化合物的分子量和分子式，并对比对照品、文献及Metlin数据库进行鉴定。见表1。

表1 藜芦中化学成分UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴别分析

图1 藜芦提取物中正、负离子模式下BPC图

3.1 生物碱类化合物 西藜芦碱型甾体生物碱是藜芦中数量最多、含量最高的一类甾体生物碱[4]。该类化合物在电喷雾离子阱质谱（ESI-MS）正模式下显示明显的[M+H]+峰，且均出现脱去中性分子氧化氢（H2O）、藜芦酸（C9H10O4）等的碎片离子信号。以化合物20、36、43说明鉴定过程。

化合物 20[保留时间（tR）=11.97 min]在正离子模式下准分子离子峰m/z 636.346 5[M+H]+，二级质谱中主要碎片离子峰有m/z 618.327 3[M+H-H2O]+、m/z 558.306 3[M+H-H2O-C2H4O2]+、m/z 438.257 3[M+H-2H2O-C2H4O2-C5H10O2]+，可发现该化合物的质谱裂解规律与计莫亭碱参考文献报道一致[4]，故推测化合物20为计莫亭碱。计莫亭碱的裂解途径见图2。

图2 计莫亭碱裂解途径

化合物36（tR=18.055 min）在正离子模式下准分子离子峰m/z 658.367 6[M+H]+，二级质谱中主要碎片离子峰有m/z 640.348 4[M+H-H2O]+、m/z 622.337 2[M+H-2H2O]+、m/z 422.270 7[M+H-3H2O-C9H10O4]+、m/z 458.289 8[M+H-H2O-C9H10O4]+，可发现该化合物的质谱裂解规律与藜芦酰棋盘花胺参考文献报道一致[4]，故推测化合物36为藜芦酰棋盘花胺。藜芦酰棋盘花胺的裂解途径见图3。

图3 藜芦酰棋盘花胺裂解途径

化合物43（tR=25.83 min）在正离子模式下准分子离子峰m/z 800.422 6[M+H]+，二级质谱中主要碎片离子峰有m/z 740.401 4[M+H-CH3COOH]+、m/z 540.340 1[M+H-H2O-C9H10O4]+，可发现该化合物的质谱裂解规律与verussurine参考文献报道一致[4]，故推测化合物43为verussurine。verussurine的裂解途径见图4。

图4 verussurine裂解途径

3.2 黄酮类化合物 从藜芦提取物中共鉴定出5个黄酮类成分，黄酮及其苷类在裂解过程中容易发生糖苷键断裂、黄酮苷元C环的逆狄尔斯-阿尔德（RDA）裂解以及一氧化碳（CO）、二氧化碳（CO2）、H2O等一些中性分子的丢失，以化合物3、27为例说明鉴定过程。

化合物3（tR=0.8 min）在负离子模式下准分子离子峰m/z 607.224 3[M-H]－，二级质谱中主要碎片离子峰有 m/z 298.112 8[M-H-C11H18O9-CH3]－，可发现该化合物的质谱裂解规律与葛花苷参考文献报道一致[13]，故推测化合物3为葛花苷。葛花苷的裂解途径见图5。

图5 葛花苷裂解途径

化合物27（tR=14.433 min）在负离子模式下一级质谱生成准分子离子峰m/z 269.046 4[M-H]－，二级碎片主要包括 m/z 241.050 9[M-H-CO]－、m/z 197.060 1[M-H-CO-CO2]－，与文献报道一致[28]，故推测化合物27为去甲汉黄芩素。去甲汉黄芩素的裂解途径见图6。

图6 去甲汉黄芩素裂解途径

3.3 有机酸类化合物 有机酸类化合物在负离子模式下响应较好，由于该类化合物中含有羧基基团，因此其分子离子峰在裂解过程中存在CO2（44 Da）的中性丢失，以化合物1、4为例说明鉴定过程。

化合物1（tR=0.799 min）在负离子模式下准分子离子峰m/z 179.054 7[M-H]－，二级质谱中主要碎片为 m/z 135.029 1[M-H-CO2]－与文献报道一致[10]，故推测化合物1为咖啡酸。咖啡酸的裂解途径见图7。

图7 咖啡酸裂解途径

化合物4（tR=0.9 min）在负离子模式下准分子离子峰m/z 133.013 7[M-H]－，二级质谱中主要碎片离子峰有m/z 115.003 6[M-H-H2O]－，可发现该化合物的质谱裂解规律与苹果酸参考文献报道一致[14]，故推测化合物4为苹果酸。苹果酸的裂解途径见图8。

图8 苹果酸裂解途径

3.4 其他类化合物 除上述3类化合物外，在藜芦药材供试品溶液中鉴定出1种香豆素类化合物，由于呋喃香豆素的结构特点，比较容易连续失去中性分子CO和CO2。在正离子模式下，保留时间为9.278 min，获得 m/z 229.085 8[M+H]+的质谱信号，二级质谱出现201.033 4[M+H-CO]+和185.113 8[M+HCO2]+离子碎片，根据数据库匹配出分子式为C14H12O3，推测该化合物为川白芷素。

4 讨论

藜芦药材中化学成分复杂，为得到分离度更好、更丰富的色谱峰，本研究对分析条件进行了多重优化。考察了甲醇-水、乙腈-水两种不同的流动相系统，结果显示乙腈-水的洗脱效果优于甲醇-水且分析时间更短，另加入0.1%甲酸后可以改善色谱峰拖尾现象，故流动相采用0.1%甲酸-水和乙腈。同时，考虑到不同化合物响应模式不同，故采用正、负两种监测模式，实现对大多数化学成分的鉴定。

UPLC-Q-TOF-MS/MS技术具有准确、快速、灵敏的特点，为全面系统研究中药成分提供了有效途径。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析了藜芦中的化学成分，并根据保留时间、相对分子质量、碎片离子等信息，结合对照品的裂解规律并参考相关文献，成功地鉴定和推测出了藜芦中的47个化合物，其中包括生物碱类36个、黄酮类5个、有机酸类4个、其他类2个。本研究建立了一种能够快速准确地鉴定藜芦药材中多种化学成分的方法，为藜芦质量评价指标的选择及药效物质基础的深入研究提供了参考。