马齿苋多糖双酶法提取工艺优化及其抗氧化性研究

杨电增，邹兰兰，钱志伟

（河南农业职业学院，河南 郑州 451450）

马齿苋（Portulaca oleraceaL.）又名五行草、麻绳菜、长命菜，为马齿苋科马齿苋树属1 年生野生肉质草本植物，在我国资源储备极其丰富，被卫生部列入既是食品又是药品的物品名单目录[1]。据文献报道，马齿苋中含有丰富的多糖、黄酮类、生物碱类、香豆素类、萜类、有机酸类物质等多种生物活性成分。马齿苋多糖（Portulaca oleraceapolysaccharides）是其主要活性成分之一，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖和阿拉伯糖组成[2]，具有抑菌、抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化、降血糖、调血脂、抗衰老、保护心血管等生理功能[3-10]。因此，有效提取马齿苋多糖对马齿苋的综合利用具有重要意义。

目前报道的马齿苋多糖的提取工艺主要有溶剂提取、超声波提取、微波提取、酶水解、高压脉冲提取以及超高压提取等方法[11-15]。而就酶法提取来说，其关键是依靠果胶酶及纤维素酶对植物的细胞壁和细胞间质中的果胶还有纤维素等物质进行水解，进一步提高活性成分的溶解速度，同时增强其溶解的效率。陈凌等[1]和钱志伟等[16]分别对果胶酶和纤维素酶提取马齿苋多糖工艺进行了优化，然而，双酶法在马齿苋多糖提取中的研究还未见报道。

因此，本研究以马齿苋为原料，使用苯酚-硫酸法测定多糖含量，探究纤维素酶和果胶酶的加入量、酶解温度、酶解时间以及液料比对多糖得率的影响，在此基础上采用正交试验优化双酶法提取马齿苋多糖的最佳工艺参数，并测定其体外抗氧化活性，为马齿苋资源的高效利用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

马齿苋（盛花期），于2020 年7 月下旬采摘于河南省农业高新科技园。置于60 ℃恒温箱烘24 h，破壁机粉碎后过60 目筛，加入乙醚进行脱脂处理，备用。

1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH,纯度99%），美国Sigma-Aldrich 公司产品；果胶酶（60 000 U/g）、纤维素酶（50 000 U/g），浙江一诺生物科技有限公司产品；双氧水、硫酸亚铁等为分析纯，国药集团产品。

1.1.2 仪器与设备

UV1901PCS 型双光束紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；D5-R2 型离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；RE2000 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；BSA423S-CW 型分析天平，德国赛多利斯集团；HH-2 型数显恒温水浴锅，上海乔跃电子科技有限公司；L18-YJ08 型静音真空破壁机，杭州生活电器有限公司；WGL-230B 型电热恒温鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 马齿苋多糖的双酶法提取

准确称取马齿苋粉末2.000 0 g，放入锥形瓶中，加入20 mL 超纯水，加入纤维素酶和果胶酶，并在pH 5.0条件下进行酶水解，酶水解后按一定料液比加入超纯水，最后于75 ℃的水浴中提取4 h。将提取液以4 000 r/min 的速度离心15 min，取上清液进行减压蒸馏，最终用超纯水定容至50 mL。

1.2.2 单因素试验设计

1.2.2.1 纤维素酶添加量的筛选

选择果胶酶添加量1.2%，酶解温度45 ℃，酶解时间120 min，液料比25∶1（mL/g），设置相对马齿苋质量的纤维素酶添加量分别为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察纤维素酶添加量对马齿苋多糖得率的影响。

1.2.2.2 果胶酶添加量的筛选

选择纤维素酶添加量2.0%，酶解温度45 ℃，酶解时间120 min，液料比25∶1（mL/g），设置相对马齿苋质量的果胶酶添加量分别为0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，考察果胶酶添加量对马齿苋多糖得率的影响。

1.2.2.3 酶解时间的筛选

选择相对马齿苋质量的纤维素酶和果胶酶添加量分别为2.0%、1.2%，酶解温度45 ℃，液料比25∶1（mL/g），设置酶解时间分别为20、40、60、80、100、120 min，考察酶解时间对马齿苋多糖得率的影响。

1.2.2.4 酶解温度的筛选

选择相对马齿苋质量的纤维素酶和果胶酶添加量分别为2.0%、1.2%，酶解时间120 min，液料比25∶1（mL/g），设置酶解温度分别为25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，考察酶解温度对马齿苋多糖得率的影响。

1.2.2.5 液料比的筛选

选择相对马齿苋质量的纤维素酶和果胶酶添加量分别为2.0%、1.2%，酶解温度45 ℃，酶解时间120 min，设置液料比分别为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g），考察液料比对马齿苋多糖得率的影响。

1.2.3 正交试验设计

依据单因素试验结果，选择纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解时间和酶解温度为主要影响因素，以马齿苋多糖得率为考察指标，进行L9（34）正交试验，考察各因素对马齿苋多糖得率的影响，正交试验因素水平见表1。

1.2.4 马齿苋多糖得率的测定

1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取20 mg 干燥至恒重的葡萄糖，用超纯水溶解定容至100 mL，并对其进行摇匀，配成0.2 mg/mL的多糖储备液，置于低温冰箱中保存（4 ℃）以备用。准确吸取一定量标准品储备溶液，并将其配制成质量分数分别为0、6.0、18.0、30.0、42.0、54.0 μg/mL 葡萄糖标准溶液。分别精确吸取2.0 mL 系列标准溶液于比色管中，各加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL 浓硫酸，充分混匀后置于沸水浴中显色20 min，之后将其取出，然后置于冷水中冷却10 min。待冷却后取出，再静置10 min。采用紫外分光光度计在490 nm 处其对吸光度进行测定[17]。将葡萄糖标准溶液浓度（μg/mL）作为自变量（x），将吸光度A作为因变量（y）进行线性回归分析，得到葡萄糖标准曲线回归方程为：y=0.016 3x+0.017 9，R2=0.998 6。葡萄糖标准品浓度处于0～54.0 μg/mL 时与吸光度存在较强的效应关系。

1.2.4.2 马齿苋多糖得率

准确称取5 份5.000 0 g 马齿苋粉，按正交试验得出的最佳提取工艺，提取液以6 000 r/min 的速度离心20 min，旋转蒸发浓缩后定容至50 mL。取马齿苋多糖提取液2 mL，依据“1.2.4.1”中的相关操作，测定其吸光度，马齿苋多糖得率的计算公式为：

马齿苋多糖得率（mg/g）=多糖质量（mg）/马齿苋粉末质量（g）

1.2.5 马齿苋多糖体外抗氧化活性的测定

1.2.5.1 DPPH·清除率的测定

分别取不同浓度马齿苋多糖提取液及VC 溶液0.2 mL 置于试管中，加入80 mg/L DPPH·无水乙醇溶液3.8 mL，摇匀，室温条件下于黑暗处放置30 min。在波长517 nm 处分别测定吸光度Ai，另分别取不同浓度马齿苋多糖提取液及VC 溶液0.1 mL 置于试管，加入3.9 mL 无水乙醇，在波长517 nm 处分别测定参比吸光度Ab；再取0.1 mL 无水乙醇，加入80 mg/L 的DPPH·无水乙醇溶液3.9 mL，在波长517 nm 处测定空白吸光度A0[18]。DPPH·清除率计算公式为：

1.2.5.2 OH·清除率的测定

分别取不同浓度马齿苋多糖提取液及VC 溶液2 mL 置于试管中，加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，再加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，摇匀，静置10 min 后，加入6 mmol/L 水杨酸溶液2 mL，摇匀，静置30 min。在波长510 nm 处分别测定其吸光度Ai；另用蒸馏水代替水杨酸溶液重复上述试验，测得参比吸光度Ab；另用蒸馏水代替样品溶液重复上述试验，测得空白吸光度A0[19]。OH·清除率计算公式为：

1.2.6 数据处理

所有数据均平行测定3 次，采用Excel 2016 和Origin 9.0 对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶添加量对马齿苋多糖得率的影响

由图1 可以看出，纤维素酶添加量0～2.5%时，马齿苋多糖得率呈现出先升高后降低的趋势。纤维素酶添加量为1.5%时，多糖得率达到最高，为18.62 mg/g；纤维素酶添加量增至2.0%时，马齿苋多糖得率略有降低，但与添加量1.5%组无显著差异；纤维素酶添加量增至2.5%时，马齿苋多糖得率继续降低。原因可能是纤维素酶浓度达到一定值后，底物浓度相对不能饱和，导致酶的作用受阻[20]。同时，结果表明双酶法提取马齿苋多糖得率显著高于单一果胶酶提取法（纤维素酶添加量0 时）得率（P＜0.05）。故选择纤维素酶添加量1.0%～2.0%用于进一步优化试验。

图1 纤维素酶添加量对多糖得率的影响Fig.1 Effects of cellulose additions on the yield of polysaccharides

2.2 果胶酶添加量对马齿苋多糖得率的影响

由图2 可知，马齿苋多糖得率随着果胶酶添加量的增加呈现出先升高后平稳的趋势。当果胶酶添加量为1.6%时，马齿苋多糖得率达到最高，为19.09 mg/g；果胶酶添加量增至2.0%时，马齿苋多糖得率略有降低，但与1.6%添加量组无显著差异。可能是由于果胶酶浓度达到一定值后，底物浓度相对不能饱和，导致酶作用受阻。同时，结果表明双酶法提取马齿苋多糖得率显著高于单一纤维素酶（果胶酶添加量0 时）提取法得率（P＜0.05）。故选择果胶酶添加量1.2%～2.0%用于进一步优化试验。

图2 果胶酶添加量对多糖得率的影响Fig.2 Effects of pectinase additions on the yield of polysaccharides

2.3 酶解时间对马齿苋多糖得率的影响

由图3 可以看出，提取获得的马齿苋多糖得率随着时间的延长而升高，到100 min 时升高到较高水平，为18.85 mg/g；酶解时间延长至120 min 时，马齿苋多糖得率略有升高，但与100 min 样品组无显著差异。故选择酶解时间80～120 min 用于进一步优化试验。

图3 酶解时间对多糖得率的影响Fig.3 Effects of enzymolysis time on the yield of polysaccharides

2.4 酶解温度对马齿苋多糖得率的影响

由图4 可以看出，在试验设计的温度范围内，马齿苋多糖得率先随着酶解温度的持续上升而升高，当温度升至50 ℃时，马齿苋多糖得率达到最大，为19.40 mg/g，而当温度继续升高超过50 ℃，多糖得率反而下降，55 ℃和60 ℃样品组与50 ℃样品组相比均存在显著差异（P＜0.05）。可能是由于温度过高导致酶活性衰减，而使酶解反应难以充分进行，导致多糖得率下降。故选择酶解温度45～55 ℃用于进一步优化试验。

2.5 液料比对马齿苋多糖得率的影响

由图5 可以看出，马齿苋多糖得率随着液料比的增加而升高，而当液料比达到25∶1（mL/g）时，多糖得率最大，为19.24 mg/g。增加提取溶剂添加量可使多糖与溶剂的接触面增大，从而促使多糖溶出。而液料比25∶1～35∶1（mL/g）时，多糖得率波动幅度相对不大，与25∶1（mL/g）样品组无显著差异。从经济性角度考虑，选择液料比25∶1（mL/g）进行后续试验。

图4 酶解温度对多糖得率的影响Fig.4 Effects of enzymolysis temperatures on the yield of polysaccharides

图5 液料比对多糖得率的影响Fig.5 Effects of liquid-solid ratios on the yield of polysaccharides

表2 马齿苋多糖提取的正交试验结果Table 2 Orthogonal test results of Portulaca oleracea polysaccharides

2.6 马齿苋多糖提取的正交试验

由表2 可知，试验中各因素对马齿苋多糖得率影响的主次顺序为：D＞B＞C＞A，即酶解温度的影响最大，果胶酶添加量和酶解时间次之，纤维素酶添加量的影响最小。对马齿苋多糖进行提取的最优组合为：A2B3C2D2，即纤维素酶添加量1.5%，果胶酶添加量2.0%，酶解时间100 min，酶解温度50 ℃。为确定最佳提取工艺条件的稳定性和可靠性，按照此条件做验证试验，重复3 次，得到的马齿苋多糖得率为(19.83±0.41)mg/g，高于正交试验中的所有试验结果，说明该工艺条件稳定可靠。

2.7 马齿苋多糖体外抗氧化活性

2.7.1 马齿苋多糖对DPPH·的清除作用

DPPH·是一种很稳定的氮族自由基，在无水乙醇溶液中呈紫色，被还原剂还原后颜色变淡甚至消失，被广泛应用于评价物质的抗氧化活性[21]。由图6 可以看出，马齿苋多糖和VC 对DPPH·的清除能力与质量浓度呈现出较强的依赖关系，通过线性回归方程计算得到马齿苋多糖的半数清除率IC50为0.182 mg/mL，而VC 的IC50为0.234 mg/mL。说明在相同浓度下，马齿苋多糖对DPPH·的清除能力强于VC。

图6 马齿苋多糖对DPPH·的清除作用Fig.6 Scavenging effects of Portulaca oleracea polysaccharides on DPPH free radical

2.7.2 马齿苋多糖对·OH 的清除作用

·OH 是一种生物体内活性最强的氧族自由基，可与水杨酸反应生成紫色物质，加入抗氧化剂后，溶液颜色变浅甚至消失[21]。由图7 可以看出，马齿苋多糖和VC 对·OH 的清除能力与质量浓度呈现出较强的依赖关系，通过线性回归方程分析，马齿苋多糖对·OH 的IC50为0.305 mg/mL，而VC 对·OH 的IC50为0.340 mg/mL，说明马齿苋多糖对·OH 的清除能力强于VC。

图7 马齿苋多糖对OH·的清除作用Fig.7 Scavenging effects of Portulaca oleracea polysaccharides on OH free radical

3 结论

我国每年都会产生大量马齿苋野生资源，大多作为饲料供动物食用或作为废弃物被舍弃。研究表明，马齿苋中含有丰富多糖成分，是一种极具经济效益的天然多糖来源。本研究对马齿苋多糖纤维素酶和果胶酶双酶法提取条件进行了优化，确定了最佳工艺条件为：纤素酶和果胶酶加入量分别为1.5%和2.0%，酶解时间100 min，酶解温度50 ℃，液料比25∶1（mL/g），此提取工艺具有良好的稳定性。最佳提取工艺条件下马齿苋多糖得率为19.83 mg/g，高于单一纤维素酶或果胶酶法提取法得率。体外抗氧化试验表明，马齿苋多糖具有较好的清除DPPH·和·OH 活性作用。本试验的研究成果为马齿苋多糖作为保健食品实现工业化生产提供了理论支持，有着良好的发展前景。