禽坦布苏病毒及其蛋白功能研究进展

陈 珍 沈意兴 陈翠腾 朱春华 刘斌琼 蔡国漳 黄 瑜＊

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物生物安全三级实验室 福州 350013；3.福建省禽病防治重点实验室 福州 350013；4.清流县龙津镇乡村振兴综合服务中心 福建三明 365300）

禽坦布苏病毒病是由禽坦布苏病毒（Avian tembusu virus，ATMUV）引起的、造成多种蛋禽产蛋下降的一种新发疫病。近年来，在我国、马来西亚、泰国等多地的蛋鸭场、种鸭场、肉鸭场暴发流行[1-3]，给养禽业造成巨大的经济损失。

1 禽坦布苏病毒的的分类与基因组结构

ATMUV属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）恩塔亚病毒群（Ntaya virus group）中的一员[1,4-6]。病毒呈球形，直径约50 nm，病毒颗粒外覆含有脂质双分子层的囊膜，镶嵌有糖蛋白突起，内含有二十面体对称结构核衣壳蛋白[7-8]。ATMUV基因组结构具有典型的黄病毒特征，均为不分节段单股正链RNA，基因组具有感染性。基因组大小约为11 kb，基因组5′端和3′端均含有高度保守的非编码区（Untranslated regions，UTR），5′-UTR长为94 nt，包含一个帽状“m7GpppAmpN2”结构，3′-UTR长为618 nt，不含多聚腺苷酸尾[7,9-12]。5′-UTR和3′-UTR之间含有一个大的开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码一个约3400 aa的多聚蛋白分子，被丝氨酸蛋白酶、弗林蛋白酶等酶解成10个蛋白，包含3种结构蛋白（Structural proteins）和7种非结构蛋白（Nonstructural proteins）。结构蛋白参与病毒感染时病毒粒子的吸附、膜融、病毒粒子组装和出芽，非结构蛋白参与病毒的转录复制，同时调控宿主的抗病毒天然免疫[13-15]。

2 坦布苏病毒结构蛋白与功能

衣壳蛋白C（Capsid protein，C）在蛋白翻译过程中首先被合成，大小约为12 kDa，是多聚蛋白前体经氨肽酶酶解其第一个Met残基而成的，是病毒组装过程中的重要元件，含有较多带正电的碱性氨基酸，与病毒基因组RNA结合组装成核衣壳，避免基因组RNA遭受酶解；同时C蛋白还可诱导机体产生免疫应答反应[16]。试验证明，C蛋白对病毒复制和成熟组装同样也发挥着至关重要的作用[17-20]。

前膜蛋白prM（Premembrane protein，prM）是成熟病毒颗粒中外膜蛋白（Membrance protein，M）的前体蛋白，分子量大小约为19 kDa。在病毒感染后期，病毒颗粒出芽释放前通过弗林蛋白酶将prM糖蛋白切割成pr蛋白和成熟的M蛋白两部分[21-22]，pr部分分泌到胞外，而M部分镶嵌在细胞外膜磷酸脂质层中，同时与C蛋白和E蛋白紧密结合，参与病毒囊膜的组成，在ATMUV病毒粒子的成熟装配和释放过程中发挥作用[23]。

囊膜糖蛋白E（Envelope protein，E）是ATMUV最大的结构蛋白和主要膜蛋白，镶嵌在病毒粒子囊膜表面，分子量约为54 kDa。作为宿主的重要保护性抗原，E蛋白能够诱导动物发生特异性免疫应答，激发机体产生中和抗体。同时在病毒复制过程中，E蛋白对病毒吸附、膜融合以及受体结合等方面同样也发挥着至关重要的作用，决定着病毒的细胞嗜性[24-25]。E蛋白属于I型膜蛋白，包含三个结构域（Domain），根据其X射线晶体结构分析可分为DomainⅠ/Ⅱ/Ⅲ[26-28]，依次从氨基端到羧基端排列。DomainⅠ是位于E蛋白的中央结构域，含3个不连续的片段，呈β折叠桶状结构，起到连接DomainⅡ和DomainⅢ的作用[29-30]。Domain I与ATMUV的细胞嗜性相关，同时也决定着病毒的毒力。DomainⅡ较为保守，形成延伸的指状结构，参与E蛋白二聚体的形成，同时含有病毒融合肽，在病毒融合过程中，介导靶细胞的细胞膜与病毒囊膜的融合。Domain III是位于E蛋白的羧基端，结构上呈免疫球蛋白IgG结构，是重要的受体结合区域。大部分抗体可识别DomainⅢ上的抗原决定簇，其功能介导病毒与细胞膜表面受体结合过程，促进病毒进入宿主细胞[29,31-32]。邵周伍林等以pcDNA-E通过转染DEF细胞后可导致受侵染的细胞发生细胞皱缩、崩解，核质浓缩、崩解等现象，提示E蛋白在诱导宿主细胞凋亡过程中发挥着重要的作用[33]。刘德建[34]研究表明，E蛋白糖基化对吸附、侵入和复制能力有一定的影响，消除E蛋白糖基化可降低病毒的装配和释放的效率，降低病毒致病性和神经毒性。赵冬敏等[35]利用免疫共沉淀试验、病毒辅覆蛋白结合分析（VOPBA）以及LC-MSMS质谱分析鉴定等技术从鸭胚成纤维细胞膜蛋白中筛选出ATMUV受体结合蛋白HSP70，为抗ATMUV药物设计提供思路。李晨曦[36]以纯化的三株抗ATMUV E蛋白单克隆抗体1F3、3B6和1A5为固相筛选分子，按照结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体随机12肽库，成功鉴定出DTMUV E蛋白的三个最小线性抗原表位221LNLPW226、374EVEPPFG380和87YAEYI91。通过对DTMUV E蛋白三维结构模拟分析发现，表位LNLPW和YAEYI位于E蛋白结构域Ⅱ，表位EVEPPFG位于E蛋白结构域Ⅲ，为黄病毒共享型的抗原表位。张琳等[37]筛选出ATMUV一个B细胞线性表位385LVGSGKGQI393（EP385），该表位具有良好的免疫原性，可为ATMUV疫苗的研制及诊断方法的建立提供基础。凡玉芳[38]通过单克隆抗体精确鉴定出一个ATMUV B细胞线性表位1FSCLGMQ7，位于E蛋白Domain I结构域内。李小康等[39]应用噬菌体展示技术，筛选出与E蛋白特异性结合的多肽：HWSTRQGSTRWN（P3-12）和THRSWQGNSWYM（P8-12）。程冰花[40]通过酵母双杂交从鸭胚成纤维细胞cDNA文库中筛选出PRDX1、PRS7、MORC3、ANTX1等蛋白，为ATMUV受体研究丰富资料。刘龙[41]研究发现ATMUV E蛋白388位作S→R突变后神经毒力和神经侵袭力都明显弱于野生亲本株，表明E388是ATMUV E蛋白关键毒力位点。

3 坦布苏病毒非结构蛋白与功能

NS1是一种高度保守的非结构蛋白，是胞外分泌的分泌型蛋白，其分子量大小为40 kDa，可粘附于感染的细胞外表面表达，并常以二聚体的形式分泌于胞外，利用NS1建立的ELISA检测方法可适用于早期感染的诊断[42]。NS1是一种多效应蛋白，不仅在病毒感染过程中的早期复制发挥着重要的作用，而且也可以与其它非结构蛋白相互协作发挥效应[43]。该蛋白是病毒复制过程中所产生的重要抗原，可诱导机体产生细胞免疫和非中和性保护力。由于NS1蛋白不是病毒粒子的成分，同时具有可溶性补体结合活性，可诱导产生非中和性保护效应[44-45]。近年来，有关TMUV-NS1研究发现，NS1蛋白可与RLRs信号通路中关键蛋白MAVS特异性结合，进而抑制I型干扰素产生以拮抗天然免疫应答[46]。王振忠[12]研究表明，NS1蛋白的表达能够下调RPS7和MDM2的转录水平，进而导致P53 mRNA的表达水平升高，可能引起相应蛋白表达水平升高，最终导致细胞凋亡的发生。

非结构蛋白NS2以两种均为疏水性蛋白NS2A和NS2B的形式出现。NS2A和NS2B是在病毒复制过程中被进一步切割而成的，二者均表现为疏水性，其分子量较小，分别为17 kDa和13 kDa。其中NS2A在病毒组装方面起重要的作用[47-49]，并且NS2A还可与NS3和NS2B相互作用[48,50]。陈舜等[51]以IFN预处理DEF可有效控制后续ATMUV的增殖，但对已经感染ATMUV的DEF细胞添加IFN则无法控制ATMUV的增殖。同时，经体外试验发现ATMUV可显著促进混合感染的鸭瘟病毒增殖。提示ATMUV能干扰IFN的抗病毒效果，明确NS2A经由阻止STAT磷酸化而抑制抗病毒IFN信号通路，从而发挥免疫逃逸功能而促进自身持续增殖。NS2B蛋白的羧基端含有与NS3互作的结构，相互作用而构成NS2B/NS3蛋白酶复合体，对非结构蛋白前体的切割加工过程中起重要作用，其作用位点位于NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS5等非结构蛋白之间的连接处。另外，NS2B还介导NS3的膜固定，并通过NS3富集NS5到膜上，形成病毒RNA复制体[52]。

NS3是一个具有多种功能的蛋白，分子量为69 kDa。其N端为丝氨酸蛋白酶结构域，C端为RNA解旋酶/核苷三磷酸酶/RNA 5′三磷酸酶结构域，具有丝氨酸蛋白酶、核苷酸三磷酸酶和RNA解旋酶等活性[53]。NS3蛋白不仅可独立调控病毒RNA复制、合成以及蛋白加工，也可与NS5蛋白形成复合物协同参与这一过程[54]。

NS4以NS4A和NS4B两种蛋白形式存在，其分子质量分别约为28 kDa和14 kDa。NS4A蛋白的作用较为广泛，在蛋白翻译后的加工过程中，NS4A与NS3蛋白酶常胶合在一起，借此能稳定NS3丝氨酸蛋白酶与其它非结构蛋白间的相互作用，提高了NS3丝氨酸蛋白酶的切割效能[12]。同时，NS4A可通过诱导自噬以防止细胞的死亡，进而对病毒的复制起到促进作用[55]；此外，NS4A还可与波形蛋白相互作用，参与病毒复制复合体的构成[56]。NS4B存在3个跨膜结构域，在功能上与NS4A相似，都可抑制干扰素信号通路以拮抗宿主免疫应答[57]。

NS5蛋白是ATMUV基因组编码最保守的蛋白，也是最大的非结构蛋白，分子量为100 kDa。常利用其编码基因3′端核苷酸对黄病毒科病毒成员进行分类[58]。NS5蛋白的C端存在RNA依赖性RNA聚合酶结构域，参与黄病毒基因组的复制；N端存在甲基转移酶（Methyltransferase，MTase）结构域。同时，NS5蛋白还具有RNA加帽活性、鸟苷酸转移酶（Guanylyltransferase，GTase）和核定位功能。此外，NS5蛋白能够协同参与宿主内多种反应机制，拮抗宿主的天然免疫反应。张吉[59]研究表明，NS5蛋白发挥关键抑制作用，ATMUV-NS5通过阻碍STATs核移位过程，进而拮抗IFN-I信号转导，从而阻碍下游JAK-STAT信号通路拮抗IFN-I信号转导过程。