早期营养干预对幼龄反刍动物瘤胃微生物区系发育的影响

张剑搏，丁考仁青，梁泽毅，Ahmad Anum-ali，杜梅，郑娟善，丁学智，2*

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省牦牛繁育重点实验室，甘肃兰州730050；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业农村部兽用药物创制重点实验室，甘肃 兰州730050；3.甘南州畜牧工作站，甘肃 合作747000；4.兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州730000）

预计到2050 年，世界人口将达到91.5 亿，届时人类对于食物的需求陡然增加，尤其对动物蛋白质的需求［1］，而反刍动物作为一种“节粮型”经济动物，通过瘤胃微生态系统将人类无法直接利用的植物纤维发酵转化为高品质动物蛋白［2］。瘤胃内的不同原核生物（细菌、古菌）、真核微生物（原生动物和真菌）与宿主互利共生、相互作用，共同形成了复杂的瘤胃微生态系统，可将纤维性饲料转化成挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）的形式为反刍动物提供约70%左右的日常能量［3−4］。近些年来，动物学家尝试开发一类新型化合物用于精准调控瘤胃关键微生物群落及发酵体系，以期使瘤胃发酵朝更高效的代谢途径进行，但收效甚微，有时其结果往往与实践相悖［5］。研究表明，发育成熟的瘤胃微生态系统对宿主微生物群落具有很强的选择特异性［6］，这将意味着任何关于瘤胃调控的措施一旦停止，则瘤胃微生物群落组成、发酵体系将恢复到原始预处理状态［7−8］。同时，研究发现瘤胃微生物的某些特征不仅可以遗传，而且可能受到宿主遗传因素的影响［9］。然而，新生反刍动物瘤胃微生态系统的发育为这种复杂微生物生态系统的调控提供了潜在“窗口期”。早期研究指出，动物早期饮食经历对其后期的饮食习惯具有更大、更持久的影响［10−11］，同时，动物早期阶段的发育可能涉及不同的生理过程且易被改变，使其能够更好地适应早期的生活环境［12］。近期研究发现，通过调控幼年反刍动物的日粮组成、饲养管理等，可以促进瘤胃内不同微生物群落的定植并产生持久影响［11，13−16］。显然，基于早期不同营养干预致使瘤胃微生物产生适应性变化，使得通过早期营养干预重塑瘤胃微生物群落成为可能。目前，尽管已在这方面做了大量基础性研究，但对宿主−微生物间的互作机制、瘤胃核心菌群的功能、瘤胃免疫功能以及微生物定植模式的改变对宿主产生的长期影响等仍缺乏了解。因此，本研究将从3 个方面进行详细地综述：1）幼龄反刍动物瘤胃的发育；2）影响早期瘤胃微生物群落定植的因素；3）宿主对瘤胃微生物群落的免疫应答，以期为通过遗传选择和育种来操纵和获得理想的、有效的瘤胃微生物群落，为进一步改善家畜生产性能和促进粗饲料的高效利用提供依据。

1 幼龄反刍动物瘤胃的发育

1.1 早期瘤胃的形态学发育

瘤胃的发育是幼龄反刍动物面临的重要生理挑战［17］，不仅需要各类细胞的持续分化及瘤胃的不断生长，同时，使营养物质输送到肠道、肝脏和外周组织的模式发生了重大变化［18］。幼龄反刍动物的瘤−网胃尚未发育完全且不具备发酵和消化粗纤维的能力，此时的幼畜主要通过皱胃（真胃）和小肠消化、吸收葡萄糖等其他营养物质获取能量；为了尽快弥补生长损失，有效利用以饲草为基础的日粮，瘤−网胃的发育及其微生物群落的定植对瘤胃的成熟发育起着关键作用［3］。

这种生理功能的巨大变化与瘤胃的发育密切相关，主要涉及3 个阶段：组织形态学的发育（瘤胃容积及突起的生长）［19］、微生物群落的定植（细菌、真菌、古菌和原生动物等）［20−21］及瘤胃代谢功能的发育（发酵能力和酶活性增强）［22−23］。研究发现，大多数瘤胃组织形态和代谢功能从14～42 d 逐渐发育，而微生物定植从出生到28 d 最快［17］。发育成熟的瘤胃不仅有利于饲料营养物质的消化吸收，也是提高反刍动物健康生产的重要基础。瘤胃组织形态的发育历经3 个阶段：非反刍期（0～3 周）、过渡期（3～8 周）和反刍期（8 周后），而过渡期内瘤胃乳突的生长和发育对后期营养物质的吸收利用至关重要，特别是VFA［17］。研究发现，随着瘤胃pH 值的降低和丁酸盐浓度的增加，上皮细胞对丁酸盐的代谢能力也随之增加；持续接触VFA 是维持瘤胃乳突生长、大小和功能的必要条件［24］。因此，VFA 的存在和吸收不仅能促进瘤胃上皮组织的代谢功能，可能亦是启动瘤胃上皮组织发育的关键［18，24］。然而，不同的VFA 对这种发育的刺激程度不同，其中丁酸盐最强，其次为丙酸盐［24］。同时，饲草料的摄入亦能刺激和促进瘤胃上皮组织的发育［17，25］，而瘤胃上皮相关微生物的建立和活性可能也是影响瘤胃上皮组织发育的另一因素［23，26−28］。

1.2 影响幼畜瘤胃发育的因素

幼畜瘤胃发育程度受许多因素的影响，其中哺乳方式、饲料组成及幼畜饲养模式等均有重要影响。研究发现，由于液体饲料（牛奶或代乳品）的化学成分及食管沟的存在，限制了犊牛早期瘤胃生理功能的发育［29］，甚至长达12 周龄［30］，且瘤胃上皮代谢活动减缓，VFA 的吸收降低［31］；而且，若犊牛从一种固体饲料和代乳品改为纯牛奶/代乳品时，其瘤胃发育甚至出现退化现象［32］。近年来，研究发现固体饲料（粗饲料）的摄入不但可以刺激瘤胃微生物的增殖及VFA 的产生，也能刺激瘤胃上皮组织的发育、增加瘤胃容积和维持表皮的完整性，甚至提高生产性能［33−35］。因此，以液体饲料为基础虽能促进幼龄反刍动物的快速生长，但并不能为反刍动物利用固体饲料做好准备。

目前，幼龄反刍动物的饲养管理模式主要分为：1）商业模式，通常幼畜与母畜分开，以代乳品或全脂牛奶饲养；2）育肥模式，通常幼畜与母畜相伴直至断奶。基于这种饲养管理模式，研究发现，与代乳品饲喂的羔羊相比，由母畜哺乳羔羊的瘤胃发育更强大［13］；同时，当犊牛与其他不同年龄阶段的牛一起饲养时，更容易学会提前采食草料，而且奶牛第一次产奶量差异的22%与生命最初几周的平均日增重有关［36−37］。因此，在商业模式下，犊牛在最初几周与母畜共同饲养有助于其后期产奶量的提升，同时，幼畜与母畜相伴可获得小剂量微生物接种的优势值得进一步关注。在集约化养殖过程中，补充浓缩料是为动物提供营养的常见方法，而为幼龄反刍动物提供早期固态浓缩发酵剂也尤为重要［17］。近年来，反刍动物瘤胃发育的研究主要集中在不同日粮组成及饲养管理系统对瘤胃发育的影响［25，38］。早期饲喂浓缩料不仅可以刺激瘤胃上皮细胞的发育，而且大粒径或高纤维的饲料可能是影响瘤胃肌肉发达和体积增加的主要刺激因素［19］，但全价颗粒饲料虽能提高犊牛瘤胃总挥发性脂肪酸和乙酸的水平，但却会抑制瘤胃纤维降解菌和厌氧真菌的生长［39］。因此，早期不同的饲养管理模式和日粮组成对幼龄反刍动物瘤胃发育具有重要作用［17，40］。

在解决瘤胃发育问题时，以下问题需引起注意：瘤胃的发育是否决定了哪些微生物的定居，宿主遗传因素是否决定了瘤胃微生物的定植类型，或者微生物是否通过自身活动及特定的信号传导来决定瘤胃发育？如表1 所示，早期不同营养干预对瘤胃重量、乳突长度及数目均有不同程度的影响。在成年动物中，饲料是微生物群落结构的主要驱动力［41］，但在幼龄反刍动物中，微生物的定植和瘤胃的发育可能存在一种互作行为。最近研究发现，瘤胃内总细菌拷贝数的遗传力估计值≥0.15，表明瘤胃微生物的某些特征是遗传的且可能受到宿主遗传的影响［9］。同时，通过宏基因组学、转录组学及定量PCR 技术研究发现，microRNAs（miRNAs）可能是协调宿主与微生物互作的桥梁［23］。Fan 等［42］研究指出，3 月龄断奶犊牛的肠道菌群受宿主基因的影响显著，而受父本基因组的影响尤为显著；同时，证明宿主基因通过微生物−微生物的相互作用间接地改变了肠道微生物群落的组成。此外，目前尚不清楚反刍动物的瘤胃类型（如上皮组织、肌化、收缩等）多大程度上是由基因预先决定的。

2 影响早期瘤胃微生物群落定植的因素

2.1 瘤胃微生物定植的时空特征

大多数动物的胃肠道在出生后被认为是无菌的，但随着哺乳行为、接触周围环境及同伴使相应微生物逐渐开始定植，最终形成复杂多样的微生态系统［18，20，23，47−48］。大量研究表明，反刍动物瘤胃微生态系统为厌氧环境，其中的微生物也全为厌氧菌，而早期瘤胃微生物却并非全为厌氧微生物［20］，但随着幼龄反刍动物瘤胃的发育，瘤胃微生物以一种特定的、渐进的顺序进行定植［49］，逐渐形成一个全为厌氧微生物组成的厌氧环境。

表1 不同营养干预对瘤胃早期发育的影响Table 1 Effects of different nutritional interventions on early rumen development

随着分子技术的快速发展和应用，发现未成熟瘤胃系统中已建立了十分复杂的微生物群落，例如成熟瘤胃系统中占主导地位的部分严格厌氧菌已在出生后1～2 d 内出现［20，50−51］，而且14 日龄的犊牛瘤胃已存在所有主要类型的瘤胃细菌，包括蛋白水解和纤维素分解的物种，甚至一些竞争菌［12］。Rey 等［14］监测了奶牛犊从出生到断奶期间瘤胃细菌群落的建立，发现在犊牛出生后这些细菌群落的建立是快速且连续的，变形杆菌门（Proteobacteria）逐渐被拟杆菌门（Bacteroidetes）所取代成为优势菌门（图1A）。Becker 等［52］首次证明，瘤胃纤毛虫是通过含活性生物的唾液直接在动物之间转移。在幼龄反刍动物出生后2 周内，通常可以在瘤胃中发现纤毛虫类原生动物，在大型纤毛虫和全部原生动物出现之前，瘤胃中就已形成了小型的纤毛虫［53−54］。但是，如果幼龄反刍动物在出生后不久便与其他反刍动物隔离，则其瘤胃内将无原生动物建立，这一特性已被广泛应用并将继续用于研究原生动物在反刍动物中的作用［53，55−57］。同时，随着分子技术的快速发展，使得早期发现产甲烷古细菌成为可能［58］。研究发现，产甲烷古细菌在固体饲料到达瘤胃之前（2～4 d）就已在羔羊未发育的瘤胃中发现，其浓度在出生后10～14 d左右便与成年动物相当［59］。同时，Guzman 等［60］在新生犊牛的瘤胃中发现了可活动甲烷微菌（Methanomicrobium mobile）、沃氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter votae）和甲烷短杆菌（methanobrevibactersp.），而真菌种群主要由Neocallimastix frontalis组成，也会发现有Sphaeromonas communis的存在，这些真菌的出现是瘤胃的另一个特征，而这些微生物以前仅被发现于成年反刍动物，显然它们能够在固体饲料进入瘤胃之前就存在于瘤胃之中。正如Stewart 等［49］所述，厌氧真菌在出生后8～10 d 混群饲养羔羊的瘤胃中已建立，其中3 周龄的所有羊羔均发现厌氧真菌的存在［20］。

除了关注瘤胃内不同菌群的定植模式外，还应注意与胃壁相关微生物群落的定植。Stewart 等［49］指出，胃壁细菌群落在出生后不久便已建立并快速达到成年体内的浓度，而且该群落的多样性似乎随着年龄而改变。Muel⁃ler 等［61］使用扫描电镜描述了1～10 周龄羔羊胃壁24 种类型细菌的形态学特征，尽管在羔羊和成年羊中仅发现7种共有类型，可认为是胃壁细菌群落的土著成员；同时，这个群落遵循一种典型的演替规律，其属水平组成在生命前10 周发生显著变化。此外，依据Mueller 等［62］的研究，从瘤胃内容物的细菌群落来看，由于大多数分离菌株可归为普通瘤胃菌属，胃壁细菌群落并未出现明显不同。然而，Sadet 等［63］使用PCR−DGGE 发现胃壁细菌群落与瘤胃内细菌群落有所不同，发现从液体饲料到固体饲料的转换影响了瘤胃细菌群落结构，但胃壁细菌群落结构并未受其影响，表明该细菌群落具有强烈的宿主效应。最近，Malmuthuge 等［64］报道了犊牛断奶前瘤胃中消化物和胃壁细菌群落之间存在巨大差异，与胃壁细菌群落相比，消化物内具有更高丰度的普氏菌属（Prevotella）和较低丰度的拟杆菌属（Bacteroidetes）。此外，粘膜细菌群落的发育与粘膜组织中一些关键免疫相关基因的表达之间存在明显的相关性［28］，表明未来瘤胃微生物定植的研究应包括瘤胃壁细菌群落。

2.2 影响早期瘤胃微生物定植的因素及最佳“窗口期”选择

瘤胃微生态系统中的各类营养生态位在早期阶段就被不同微生物占据，并且微生物定植的关键转折点在于固体饲料的摄入［14］。目前，已有充分证据表明厌氧微生物在瘤胃早期阶段就已定植［20，50−51］，但鲜有研究将早期阶段微生物的定植模式与某些影响微生物群落定植的因素（如：母体影响、幼畜管理模式、液体/固体饲料、添加剂的使用等）进行比较。

瘤胃微生态系统内的不同原核生物（细菌、古菌）、真核微生物（原生动物和真菌）与宿主互利共生，但原生动物对于正常瘤胃功能并非不可或缺［53，65］，但是它的存在与否却与不同细菌群落、产甲烷菌群落的结构以及不同瘤胃发酵模式有关［56−57］。研究发现，原生动物和真菌是瘤胃真核组的代表，占微生物生物量的50%［66］，且真菌孢子内的碳水化合物能为瘤胃原生动物提供能量［67］。成年反刍动物的瘤胃拥有独特的原生动物种群［A 型为多甲属（Polyplastron）、B 型为前毛属（Epidinium）］，研究发现，若将多甲属引入拥有B 型原生动物种群的动物瘤胃中可导致B 型原生动物的消灭，然而，在大多数绵羊种群中，却存在着大致相同数量的A 和B 型原生动物种群，显然有一些未知的宿主因素影响原生动物对绵羊瘤胃的定植［53］。早期研究报道，在断奶前后饲喂饲草或浓缩料将决定一些厌氧菌的浓度，加速瘤胃微生物群落的定植［68］。Skillman 等［69］利用双胞胎羔羊来鉴定羔羊瘤胃中的产甲烷菌，发现双胞胎羔羊瘤胃产甲烷菌种群之间具有相似性，表明母羊可能是产甲烷菌的主要来源。最近一项关于幼龄反刍动物瘤胃抑制甲烷（bromochloromethane，BCM）生成的研究进一步支持了母体的重要性［70］，研究指出羔羊瘤胃古细菌群落的建立取决于其母羊是否接受了BCM 处理，这表明任何用于幼龄反刍动物的早期干预措施，都应将同样的处理应用到母畜身上［70］。Yáñez-Ruiz 等［71］发现不同日粮组成影响了羔羊瘤胃细菌群落的定植，这种影响持续了4 个月，提示进一步探索利用日粮或食用添加剂调控成年动物体内微生物种群的可行性。Abecia等［13］、Belanche 等［55］发现，人工喂养和母羊喂养的羔羊表现出了不同的瘤胃原生动物定植模式。Abecia 等［13］表明，与喂养代乳品的羔羊相比，母羊喂养的羔羊瘤胃在不断发育过程中pH 值持续降低，推测由于群体行为学习的原因，母羊喂养的羔羊容易消耗更多的体能去学习某些行为。因此，在瘤胃发育过程中不同的pH 环境对某些微生物群落的定植更有利，也可能形成不同的微生物群落。

除了在断奶前后引入固体饲料外，早期阶段的营养干预还有直接接种特定的微生物以及使用抑制（或促进）某些微生物群落定植的化合物等。关于给动物饲喂具有活性的微生物已不再是一个新颖的概念［72−73］，研究表明为断奶犊牛提供成熟瘤胃的提取物［47，74−75］、某些瘤胃真菌（如Neocallimastixsp 等）［76］或发酵饲料（如，乳酸菌等）［77−78］，不仅能增加犊牛的采食量和体重，也能刺激犊牛瘤胃的发育。此外，为羔羊瘤胃连续7 d 接种新鲜瘤胃液，可使早期断奶羔羊的平均日增重和消化能力均提高［79］；在犊牛喂奶1 h 后给予普氏栖粪杆菌（Faecalibacteri⁃um prausnitzii），可以显著降低犊牛的腹泻率和死亡率，且显著增加犊牛断奶后的平均日增重［80］；在犊牛日粮中添加2%的酵母培养物不但可以增加干物质的摄入和促进生长，也能轻微地改善瘤胃的发育［31］。因此，使用瘤胃益生菌［如埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii），丙酸杆菌（Propionibacteria）等］不仅能直接调节瘤胃发酵参数，也有助于其他有益菌群的生长［78，81−82］。

此外，利用无菌饲喂的幼龄动物接种特定的微生物已成为研究特定微生物功能的一种新型方法。目前，利用该方法探究瘤胃内直接参与H2代谢的微生物群落，结果发现产氢产乙酸菌最先在瘤胃内定植，随着瘤胃的发育逐渐被产甲烷的古细菌所取代［58］。Fonty 等［83］通过无菌羔羊证明，在缺乏瘤胃产甲烷菌的动物中，产乙酸菌的引入使其还原产生的乙酸成为主要的产氢过程，且这种干预措施在产后的12 个月仍然有效。Gagen 等［58］为研究产甲烷菌对瘤胃产乙酸菌群落的影响，利用自然出生的羔羊（与其母羊一起生活17 h 后分离）放入无菌隔离器进行无菌饲养，为其接种了纤维素分解细菌，随后又接种了Methanobrevibactersp.87.7，发现出生17 h 后隔离的羔羊瘤胃中已存在产甲烷菌；尽管这些羔羊瘤胃产甲烷菌的数量较低，但其甲基辅酶还原酶A（methyl coenzyme re⁃ductase A，mcr A）基因的多样性却与2 岁正常绵羊无差异，这表明产甲烷菌定植可能在早期瘤胃中持续存在，并支持生命早期阶段对微生物重构的潜力。他们认为，若有可靠的方法从动物早期生活中除去产甲烷菌并接种产乙酸菌，可能是减少成年反刍动物甲烷排放行之有效的方法。因此，关于早期对产甲烷菌的抑制，使用抑制某些微生物群落的建立或促进其他微生物群落发展的化合物现已引起人们的注意。Abecia 等［21，84］研究表明，对幼龄山羊施用BCM 改变了瘤胃古细菌的定植，使其甲烷排放量减少约50%且断奶后效果仍持续3 个多月。

综上所述，鉴于某些特定因素有利于微生物的定植，掌握早期阶段营养干预的最佳窗口期尤为重要。近期研究表明，瘤胃微生物的最初定植在出生后即刻发生，且细菌群落结构需要3～4 周才能达到相对稳定（图1B）［13，22−23，60］。Griffith 等［85］研究发现，成熟瘤胃微生态系统更加稳定，一些营养干预措施不能长期有效，一旦干预措施停止将即刻恢复原始状态，这就意味着微生物群落一旦保持相对稳定就失去了“重构”机会。同时，研究发现正常反刍动物瘤胃中微生物的定植早于其功能的发育，而解剖学上的发育最后才形成［17］，但这种变化与瘤胃微生物的实际定植时间有关，更重要的是这种过程的持久性仍需要进一步阐明。因此，迫切需要更多的基础研究来进一步解决这一问题。

3 宿主对瘤胃微生物群落的免疫应答

动物胃肠道拥有各种非特异性与特异性的保护机制，使其与常驻菌群共存［90］。若机体在营养吸收、共生微生物的耐受性及病原性微生物的屏障等功能上产生了冲突，则需要结合生理、生化和细胞机制的综合系统来保护胃肠道粘膜免受病原体的侵袭［91］。机体免疫系统需要学习处理微生物负荷的训练过程已经被广泛强调，这在生命的早期阶段尤为重要［92−93］；然而，目前对瘤胃第一批定居者的“耐受性”机制尚不清楚。

反刍动物瘤胃特殊的发酵性质及瘤胃壁对微生物的不断暴露，使其影响瘤胃的某些生理因素可能不同于其他胃肠道部位。正如Trevisi 等［94］所述，与常见的肠道免疫研究相比，关于反刍动物瘤胃上皮免疫系统的研究鲜有报道。通常，肠道粘膜区域的免疫反应是由粘膜相关淋巴组织（mucosal-associated lymphoid tissue，MALT）和肠道淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue，GALT）协调作用的结果。然而，瘤胃上皮组织由多达15 层的细胞层组成，却不含淋巴组织，这可能限制了大分子的渗透性［95］。因此，瘤胃微生态系统的平衡是由多种机制的组合共同实现的，如图1C 所示：需要唾液持续提供免疫球蛋白（immunoglobulin A，IgA 和immunoglobulin G，IgG）［96］、活性Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）［28］、一组基因编码模式的识别受体（pattern recognition recep⁃tors，PRR）［97］、肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition proteins，PGLYRP1）［28］及抗菌肽（防御素）［28，87］共 同作用。

图1 瘤胃微生物群落的定植，生态系统发育历程和免疫调节组分［28，86-89］Fig.1 Colonization of microbial communities，rumen microecosystem development history and illustration of different elements of the immune-regulation

动物血清中含有针对多种抵抗革兰氏阴性细菌（特别是肠杆菌）的循环抗体［98］，但这类抗体被认为是在未明显感染情况下产生的天然抗体。Sharpe 等［99］在牛、绵羊、山羊和马的血液中发现了针对瘤胃细菌特定菌株的抗体，吸收试验显示反刍动物的天然凝集素抗体具有高度特异性，但在猪、兔子和人类的血液中却没有。瘤胃微生物的能动性与其激发天然抗体能力之间似乎存在着密切的关系，因为该类抗体可以抵抗能动性强的丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、链球菌（Streptococci）和乳酸杆菌（Lactobacilli）；进一步研究表明，这类抗体主要存在于初乳中并转移到小牛血清中［100］。同时，研究发现犊牛出生后12 h 内延迟供给初乳，将造成IgG 被动转移受阻，延迟肠道细菌的定植，可能引发犊牛感染病菌［101］。虽不排除离开皱胃无活性的瘤胃细菌是小肠抗原刺激来源的可能性，但早期一项将盲肠作为抗原刺激替代部位的研究发现，盲肠内的许多细菌与瘤胃内的细菌相似，瘤胃上皮为非腺性的角质化组织，而盲肠上皮组织却含有淋巴组织和浆细胞，但盲肠作为活跃免疫器官的作用有待进一步研究［102］。Sharpe 等［100］用4 只以牛奶、发酵剂和草料饲养的无菌羔羊来研究早期瘤胃微生物定植与抗原产生之间的关系，为其分别接种了韦荣氏球菌属（Veillonela）、栖瘤胃普雷沃氏菌属（Prevotella ruminicola）、瘤胃球菌属（Ruminicoc⁃cus）、新月形单孢菌属（Selenomonas）、巨球形菌属（Megasphaera）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、丁酸弧菌属（Bu⁃tyrivibrio）和大肠杆菌（Escherichia coli），发现普雷沃氏菌属、新月形单孢菌属和巨球形菌属产生了很强的免疫应答，其中普雷沃氏菌属、新月形单胞菌的抗体在接种后20～40 d 出现，而且球形菌属的抗体在28～74 d 出现；凝集素对韦荣氏球菌属和瘤胃球菌属的作用较弱，仅在接种后100～136 d 才出现。不出所料，未接种的细菌未检测到凝集素，而且未得到初乳的无菌羔羊出生时仅有微量的免疫球蛋白，在74～77 d 后合成了相当数量的免疫球蛋白（immunoglobulin M，IgM）和相对较少的IgG，但在第140 天时，IgG 水平却上升到与IgM 相当的水平。因此，这些结果证明了瘤胃微生物定植和特异性抗原产生之间具有密切联系。如前所述，唾液可能是引入免疫球蛋白的主要载体。在探索反刍动物接种疫苗对抗特定瘤胃微生物可能性的背景下，分别对牛血清、唾液和瘤胃液中IgA 和IgG 的水平进行了研究［103］。这些研究证实，牛唾液和瘤胃中主要的免疫球蛋白类型为IgA；相反，血清中的主要类别是IgG；与IgG 相比，IgA 显然更能抵抗瘤胃微生物的降解，可能是IgA 的某些分泌成分使免疫球蛋白对瘤胃中的蛋白酶活性更具抗性［104］。虽然开发特异性瘤胃微生物疫苗的研究证明，增加唾液中免疫球蛋白的摄入量是可以实现的，但通过唾液不断供应免疫球蛋白在塑造共生微生物群落中的作用，以及这种先天应答功能在瘤胃发育过程中的作用尚不清楚。

动物日粮的改变会导致瘤胃微生物群落比例的变化，但免疫系统如何应对这种变化却鲜为人知［105］。通过研究不同易感性酸中毒动物的瘤胃上皮TLR4 基因表达的变化，发现胃壁细菌总16S rRNA 基因拷贝数与瘤胃pH、总VFA 浓度、TLR4 基因表达之间存在相关性，预示上皮组织的先天免疫反应与胃壁细菌的活性有关［106］。目前，反刍动物中总共研究了10 个TLRs［28，86，89，97，106］，主要分为两组：1）TLRs1、TLRs2、TLRs4、TLRs5、TLRs6、TLRs10，主要在细胞表面表达并识别细菌表面相关分子模式；2）TLRs3、TLRs7、TLRs8、TLRs9，主要识别来自病毒和细菌的特定核酸。尽管已知成年反刍动物瘤胃上皮具有天然抗体存在，但很少有研究涉及幼龄反刍动物。Malmuth⁃uge 等［28］研究发现随着犊牛年龄的增长，瘤胃、空肠、回肠、盲肠和结肠中大部分TLRs的表达明显下调；且犊牛断奶前β-防御素和PGLYRP1 的表达受到限制，表明此时犊牛胃肠道上皮免疫系统发生了显著的发育变化。同时，新生反刍动物可能依赖TLRs作为主要的先天免疫机制监测断奶前瘤胃共生菌群和病原体，随着年龄的增长其他先天免疫机制在宿主防御及减少有害炎症方面变得更积极［28］。目前尚不清楚TLR的表达水平在多大程度上对瘤胃不同微生物的定植模式起作用。有趣的是Liang 等［27］研究发现miRNA 在犊牛早期胃肠道（包括瘤胃）发育过程中具有潜在的调控作用，首次发现双歧杆菌或乳酸菌的16S rRNA 基因拷贝数与瘤胃上皮组织中miR-15/16、miR-29、miR-196 的表达水平呈正相关（P<0.05）；同时，发现这3 种miRNA 可能是淋巴组织发育（miR-196），树突状细胞成熟（miR-29）和免疫细胞（miR-15/16）发育的重要启动元件，为宿主−微生物间的相互作用调控胃肠道发育机制提供了新证据［27］。同时，随着年龄的增长，肠道微生物群落的定植及微生物的代谢功能发育逐渐加快，这可能为微生物群落−代谢组−免疫系统在发育过程中的相互作用提供新的线索［85］。

综上所述，关于不同定植模式对早期瘤胃免疫系统的影响及长期影响的研究鲜有报道。可以假设，如果在早期阶段阻止了某些特定微生物群落的定植，若该菌群在以后的生活中重新定植时，那么免疫系统很可能不会识别该类菌群，宿主可能会对其产生免疫反应；也许这是一种调控特定菌群定植的方法，但这并不适用于早期瘤胃原生动物的定植模式［55］。尽管如此，仍需更多的基础研究来揭示不同微生物定植模式对动物的免疫反应，以及接种未知菌群后瘤胃如何适应。

4 展望

瘤胃微生态系统的早期建立对瘤胃机能的完善及肠道健康和机体免疫系统的完善至关重要。目前，研究发现早期营养干预确实可以影响早期瘤胃微生态系统的发育，但瘤胃微生物群落的定植规律、核心菌群间的相互作用机制以及宿主−微生物间的免疫互作机制仍有待解决。因此，后续关于幼畜瘤胃微生态系统发育的研究有必要进行长时间的试验，真正评估早期营养干预对动物的生产性能及健康的影响。同时，还应从以下几个方面研究：

1）综合多种组学技术（基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等）深入研究早期瘤胃微生态系统发育，深度挖掘核心菌群的定植及其代谢功能的形成，探索核心菌群间的复杂网络系统，寻找最小驱动菌群，以期实现精准调控瘤胃微生态系统，提高反刍动物的生产性能及健康水平。

2）早期营养干预对调控幼龄反刍动物瘤胃微生态系统发育具有巨大潜力，应进一步深入探究早期瘤胃液移植，瘤胃益生菌、粗饲料等的摄入对幼龄反刍动物的长期影响作用，开发用于提高反刍动物粗饲料利用、降低甲烷排放的早期营养干预措施。

3）瘤胃微生态系统作为一个潜在的宝贵生物资源，拥有独特的发酵体系、多样的微生物资源及丰富的酶资源，为了深入挖掘其巨大的潜在价值，就必须筛选目标菌群、分离培养获得单独菌株；同时，结合宏基因组、宏转录组、宏蛋白组及宏代谢组等技术深入挖掘菌株信息，明晰代谢通路，找到编码特定酶类的目标基因，以期利用基因工程获得大量微生物资源和酶类资源。

4）通过深入研究幼龄反刍动物瘤胃内免疫系统的构建，在分子水平上确定与早期微生物定植相关的关键免疫元件，有助于理解宿主−微生物间的免疫互作机制。

5）确定反刍动物和瘤胃微生态系统的理想表型，利用基因组技术逐层解析该表型的生物学基础，最后，采用动物育种与微生物育种相结合的新型育种模式，培育高产、优产的动物新品种。