GelMA 水凝胶在骨组织工程中的研究进展

张孝利（综述） 余优成（审校） 吴兴文 孙 健

（复旦大学附属中山医院口腔科 上海 200032）

自19 世纪60年代起，瑞典的Branemark 在实验中偶然发现纯钛可以和骨组织发生紧密结合，之后他提出“骨结合”理论，为当代口腔种植学的发展奠定基础[1］。种植修复目前是牙列缺损、牙列缺失首选的修复方法。患者因牙周炎、长期牙缺失、全身疾病、外伤及肿瘤术后的牙槽骨缺损是种植修复的一项难题。充足的骨量是种植体完成骨结合并维持其长期稳定的必要条件，种植位点骨量严重不足须进行骨增量手术[2］，因此在临床上需要有效填补骨缺损的材料。目前骨移植方法有：自体骨移植、同种异体骨异种骨和人工骨移植。尽管自体骨移植是目前骨移植材料的“金标准”[3］，但它可能导致的并发症（如供区发病和移植失败等）是对大多数医师的挑战。同种异体骨移植经过辐照或冷冻干燥处理而失活，降低了骨诱导性，最终可能导致移植失败[3］。同时，同种异体骨的取材问题也无法满足临床需求。

在临床迫切需求的驱动下，骨组织工程应运而生。 最近的研究表明，明胶甲基丙烯酰基（gelatin methylacryloyl，GelMA）水凝胶因其独特的光交联特性，可以加工成不同形貌的水凝胶支架材料。同时，因其降解性能可控，力学性能可控，生物相容性好，在骨缺损修复材料领域具有广阔应用前景，所以基于GelMA 的水凝胶在骨组织工程的应用引起了广泛研究。

GelMA 特点GelMA 是一种明胶衍生物，由Van Den Bulcke 等[4］于2000年首次合成。明胶是胶原蛋白的水解产物，具有溶解性好、抗原性低等优点[5］。 另外明胶保持了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）氨基酸序列，这有利于细胞黏附、增殖和分化[4］。 明 胶 含 有 基 质 金 属 蛋 白 酶（matrix metalloproteinase，MMP），有利于细胞重塑和进一步提高明胶理化性质[6］。GelMA 水凝胶通常是由甲基丙烯酸酐与明胶反应得到，并且在光引发剂下进行光交联产生的。光交联可在温和的条件（室温、中性pH 值等）进行。GelMA 水凝胶因含有少于5% 的甲基丙烯酸酐，使明胶的大多数功能性氨基酸基序，包括RGD 和MMP 不受显著影响，从而保留明胶的大部分性能[7］。

与其他现有的水凝胶形成生物材料相比，GelMA 水凝胶可通过添加各种生物材料或者不同的合成工艺来满足骨组织工程应用材料的要求。

GelMA 与成骨生成相关研究

工艺因素对骨再生性能及机械力学性能的影响 不同研究发现通过改变聚合物浓度、甲基化程度和紫外光强度等，可对骨再生性能或力学性能产生影响。Celikkin 等[8］通过研究凝胶浓度对水凝胶支架骨再生性能的影响，发现5%（w/v）GelMA 水凝胶和10%（w/v）GelMA 水凝胶在骨髓间充质干细胞成骨分化培养基中，均表现出良好的成骨分化。研究发现GelMA 水凝胶的孔径与合成过程中使用的GelMA 浓度成反比。5%（w/v%）GelMA 水凝胶具有明显较大的孔径，使同源钙离子通过率和扩散率增加。结果表明，5%GelMA 浓度的水凝胶体外骨再生性能优于10%GelMA 浓度的水凝胶。

尽管GelMA 水凝胶具有细胞黏附、增殖、分化等利于成骨的性质，但力学性能不足限制了其作为承载材料的应用。Wang 等[9］采用光交联聚合的方法，利用GelMA 和葡聚糖甲基丙烯酸缩水甘油酯（dextran glycidyl methacrylate，DexMA）制备了新型双组分聚合物水凝胶GelMA-DexMA。 通过控制甲基丙烯酸缩水甘油酯在DexMA 中的取代度（degree of substitution，DS），可以获得较好的机械性能。结果表明，GelMA-DexMA 呈蜂窝状结构，孔径随DS 增加而减小，表现出较低的溶胀比和较高的压缩模量。

聚合过程中的紫外线UV 剂量也在GelMA 的机械性能中起关键作用。例如，增加紫外线剂量会降低细胞的整体存活率，而优化紫外线照射时间可以在保持细胞存活率和促进细胞分化水平的同时改善机械特性[10］。Wang 等[11］采用紫外光交联法合成了GelMA/聚乙二醇二丙烯酸酯（poly ethylene glycol diacrylate，PEGDA）水凝胶，通过改变光引发剂I2959 和PEGDA 的用量，可以很容易地控制胶凝时间。另外研究发现此型凝胶的机械强度、扩散速率和溶胀速率均有所提高，力学性能远远超过GelMA。

加入不同材料对骨再生性能及机械力学性能的影响 骨移植材料都应至少具备以下一种生物特性：（1）骨传导性，提供支架帮助组织长入和新骨沉积；（2）骨诱导性，分泌因子诱导骨前体细胞分化成骨；（3）成骨作用，提供具有成骨潜能的骨祖细胞。

骨缺损修复材料还需要有较好的结构稳定性。由于GelMA 的柔韧性不理想，成膜结构脆弱以及操作困难等，所以不利于作为人工骨材料应用。 因此，Wang 等在GelMA/PEGDA 的基础上加入纳米羟 基磷灰 石（nano-hydroxyapatite，nHA），制备了GelMA-PEGDA-nHA 复合水凝胶涂料。与GelMAPEGDA 水凝胶相比，nHA 的加入可以控制复合水凝胶的力学性能并降低降解速率。

各种磷酸钙已被用作骨替代材料，而不是自体移植物。其中，羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）和可生物降解的磷酸钙在临床上应用最为广泛。磷酸八钙（octacalcium phosphate，OCP）是一种可生物降解的材料，有人认为OCP 是骨骼和牙齿磷灰石晶体的前身[12］。Anada 等[13］采用两步数字光处理技术，用含有OCP 的GelMA 环来模拟骨皮质，进一步证明在凝胶中均匀嵌入的OCP 能促进间充质干细胞向成骨细胞分化。Qiao 等[14］合成了一种光交联的成骨增强肽（osteogenic growth peptide，OGP），然后通过GelMA 共交联OGP 生成了GelMA-c-OGP。GelMA-c-OGP 的机械压缩性能达到90 kPa，优于GelMA。而且Gelma-c-OGP 具有降解作用，有利于OGP 的释放。此外，GelMA-c-OGP 水凝胶支架在体外可促进成骨细胞的分化，增加新骨的形成。

脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）已经成为骨再生领域研究最多的材料之一，并被定位为有吸引力的替代物。因此Ramis 等[15］研究采用C2C12 细胞和脐带间充质干细胞体外诱导成骨，体内异位成骨模型通过配制甘油（Gly）、透明质酸（HA）和GelMA 分别作为DBM 载体，比较其物理化学性能，如微观结构、抗压强度和血清黏附性以及细胞毒性试验和碱性磷酸酶的活性，以此评估DBM 在体外诱导分化为成骨细胞的效果。研究结果表明，在物理化学性能测定方面，GelMA 制剂作为载体优于其他制剂。另外，GelMA 具有更加致密的结构、低细胞毒性和高碱性磷酸酶活性，相比而言具有最大的骨诱导潜力，而且新骨和骨髓形成的比例更高。

Zheng 等[16］制备一种由有机-无机复合生物诱导的水凝胶，其通过连续的物理和化学交联方法，运用生物活性玻璃（bioactive glass，BG）和GelMA制备复合材料水凝胶，同样使其压缩模量显著提高。除此之外，在凝胶中加入BG 还可以显著提高该复合水凝胶的稳定性和生物活性，从而促进细胞附着、增殖和成骨分化。除了可加入BG 以外，Xin等[17］将 生 物 活 性 玻 璃 纳 米 粒 子（mesoporous bioactive glass nanoparticles，MBGNS）作为无机组分制备了一种新型增强型GelMA 复合交联材料，即具有双网络结构的GelMA-G-MBGNS 水凝胶。相比较BG/GelMA 复合水凝胶，GelMA-G-MBGNS水凝胶具有结构稳定性更好，力学性能优，降解速率可控，周围微环境稳定的优点。内环境稳定对细胞增殖和分化具有重要意义，因此，这种水凝胶膜的应用可能为骨组织工程中治疗骨缺损和其他类型的损伤提供一个好的材料。

机械性能也是设计成功的骨缺损修复材料所必需的。添加刚性材料是改善凝胶机械强度的一种方法。由GelMA 和纳米金刚石（nanodiamonds，Nds）组成的新型纳米复合水凝胶，既控制间充质干细胞（HASCS）的成骨作用，也增强了GelMA 水凝胶 的力学性能[18］。同样 道理，将GelMA 与HAP 混合，成功地制备了GelMA-HAP 复合化水凝胶，其力学强度高于纯GelMA 水凝胶。Levett 等[19］也通过在GelMA 凝胶中加入糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）改善凝胶的力学性能。

不仅如此，相关研究发现水凝胶和支架之间的共价键结合也可以提高机械强度。

GelMA 与血管生成相关研究骨是一种高度血管化的组织，具有独特而复杂的结构。骨替代材料被植入大型骨缺损时，血管化不足常常导致骨再生不良。在大块骨移植中实现早期血管形成以提供营养和氧气仍然是一个挑战。

血管能够为细胞提供营养和氧气[20］，避免了相关组织坏死，所以血管对于治疗骨缺损尤为重要。骨由包含血管渗透网的外周皮质和高度血管化的内部骨髓间隙组成。Anada 等[13］采用两步数字光处理技术，用含有OCP 的GelMA 环来模拟骨皮质，用含有人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的中心GelMA 环来模拟骨髓腔，以制备骨仿生的3D 水凝胶材料。这种具有仿生双环结构的细胞负载型水凝胶骨构建物有望应用于骨组织缺损的修复中。

血管内皮生长因子被认为能促进血管生成。运用含有不同浓度血管内皮生长因子的GelMA 水凝胶可以促进微血管形成[21］，并通过3D 打印方法确定结构。Lai 等[22］制备了载有血管内皮生长因子的GelMA/carboxybetaine methacrylate（CBMA）水凝胶，可以在体内控制血管内皮生长因子释放，从而诱导更大程度的血管生成。

Byambaa 等[21］提出了这种基于挤压的直接生物打印方法，可用于制造具有血管功能的类骨组织结构。 其中含有人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cell，HMSC）和血管内皮生长因子的GelMA 水凝胶通过3D 打印使可灌注血管的形成成为可能。 另外他们设计用硅酸盐纳米片的GelMA-HMSC 水凝胶作为外层诱导成骨，促使微血管形成。然而，这种方法只能确保通道附近的细胞存活。使3D 打印的支架向成熟组织转变，将血管生成方面相容性高的细胞与良好的3D 打印特性结合起来仍然是需要解决的重要问题。Stratesteffen[23］将胶原蛋白加入水凝胶中形成水凝胶混合物（GelMA-collagen blends）增加了细胞间的聚集能力。

细胞微环境在改善组织的细胞反应和功能方面起着至关重要的作用。 模拟天然细胞外基质（extracellular matrix，ECM）并能够释放生长因子的支架是组织工程应用研究的重要内容。Modaresifar等[24］通过光聚合制备水凝胶，开发了GelMA/壳聚糖纳米颗粒复合水凝胶以递送血管生成生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）。由于其生物相容性结构和提供bFGF 持续释放的情况，GelMA/壳聚糖纳米颗粒可以显著促进细胞增殖。这种水凝胶支架可用于在各种应用中有效递送bFGF，特别是用于血管生成。

除了解内源性血管因子的血管化作用，还要了解外源性血管内皮生长因子血管化作用。研究表明，无血管内皮生长因子的Integrin a2b1 整合素特异性的多肽GFOGER 型水凝胶体内血管化水平高于无血管内皮生长因子的Integrin avb3 整合素靶向多肽GRGDPC 型水凝胶，并与含有血管内皮生长因子grgdpc（RGD）水凝胶体内血管化水平相似，证实了整合素单独指导和引导血管生成水平和调节血管生成蛋白的生物学活性的能力，所以在再生医学应用中开发整合素特异性十分重要。生长因子蛋白质价格的昂贵和重要的监管问题，通过简单的功能化技术来设计支架以减少或完全消除对生长因子的需求，可以大大提高未来再生医学构建的临床疗效[25］。

在促进血管生成的因素中，某些离子最近被认为是一种有效的元素。Dashnyam 等[26］设计了一种支架，将藻酸钠水凝胶注入纤维支架中。他们采用表面硅酸盐涂层技术，使负载的硅酸盐离子持续释放在一周以上，诱导血管生成和促进表面成骨活性。研究证实通过硅酸盐离子促进血管生成，血管加速生成刺激骨骼修复过程。此种复合型水凝胶具有可加工性、形状可塑性等优点。

Vishnu 等[27］以甲壳素和聚丁二酸丁二醇酯（polybutylene succinate，PBSu）为原料，分别以（250±20）nm 纤维蛋白纳米粒（fibrin nanoparticles，FNPs）和掺镁生物玻璃（magnesium-doped bioglass，MBG）为载体，制备了可注射的水凝胶体。研究证明含有2%MBG 和2%FNPs 的水凝胶体系既能促进血管化，也能促进成骨，而且这种凝胶有可能用于不规则骨缺损的有效再生。

结语GelMA 水凝胶因其独特的特质，所以在骨缺损修复材料领域具有广阔应用前景。随着生物医学和材料科学知识及技术的不断发展，基于天然水凝胶的生物材料在骨组织工程的应用研究取得了诸多进展，并且已经开始进行临床转化。然而需要研究具有良好的成骨性能、机械性能、血管功能化凝胶支架以及精确成形支架是目前骨组织工程应用研究的内容以及挑战。随着组织工程学的发展以及研究的深入，有望构建出高度仿生的骨缺损修复材料，以便更好地用于临床。

作者贡献声明张孝利，孙健 研究构思，文献整理及论文修订。余优成，吴兴文 文献收集，论文修订。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。