免疫细胞分离鉴定综合实验设计

孔小丽， 陈 思， 陈玮琳， 黄 钟

（深圳大学医学部基础医学院医学教学实验中心，广东深圳518060）

0 引 言

医学免疫学是一门研究人体免疫系统结构与功能，连接基础与临床研究的重要学科。随着实验科学技术的发展，国内越来越多高等医学院校增设免疫学实验课程。

实验课程是学生获取理论知识及对其加深理解的重要途径。目前，医学免疫学的理论教学改革已深入开展，伴随着免疫技术的迅速发展，实验教学方面的改革尚略显滞后［1-3］。免疫细胞的分离鉴定是经典的基础医学实验之一，对临床医学本科生学习免疫细胞及其功能，了解免疫系统及免疫应答等相关知识具有重要意义［1-4］。国内各大高校仍较少有将该大型贵重仪器运用于本科生实验教学工作中。在学校现有大型贵重仪器平台的基础上，对经典实验教学进行升级，形成一个具有研究性综合性的实验教学，不但有利于学生巩固掌握所学的理论知识，拓展学生的视野，还提升大型贵重仪器的使用率。

1 大型仪器设备的培训

对大学生在使用大型仪器设备前的培训是使用大型贵重仪器进行实验教学成败的关键。培训主要是采用翻转课堂教学方法进行的。教师提前录制显微镜流式细胞分析仪操作演示视频和软件分析视频，并上传分享到专门的网站、微信教学公众号或微信班级群，学生课堂前采用智能手机、平板电脑等工具，借助互联网信息技术，线上自主观看学习相关的教学材料。课堂上显微镜普通观察操作由学生完成，设备专管技术老师辅助监督，仪器软件数据分析采集由任课教师辅助完成，引导学生分析问题，解决问题，对理论知识进行消化理解。

（1）正置荧光显微镜。实验教学采用的是奥林巴斯BX51 正置荧光显微镜，主要由物镜，荧光激发块、荧光激发光源、图像系统等基本构件组成。其具有UIS2 光学系统，能够完成出色的荧光观察和微分干涉差观察；显像图像软件Cellsens 能够完成理想的免疫细胞图像处理。

（2）流式细胞仪。碧迪医疗公司（Becton Dickinson，BD）分析型流式细胞仪具有488 nm 和633 nm双激光检测器，可同时进行4 色检测。课堂上采用的型号为FACS Calibur及FACS C6 Plus。流式细胞仪主要由液流系统、光路系统、流动室和电子控制系统组成［1-2］，可分析细胞大小、浓度、细胞内或细胞外蛋白质表达等，给科研实验室或临床研究提供相关重要结果［6-7］。课堂上重点讲解仪器的软件数据分析，包括FSC、SSC、A、W、gate 等常用术语的介绍，FSC-SSC 物理参数图，单参数图，双参数图的表示和样例数据分析。

流式细胞仪分离鉴定法与传统方法如尼龙毛柱分离法、粘附分离法等相比，具有快速、准确、多参数分析等特点［5-7］，能直接计算显示出各类细胞的相对含量，同时保持细胞的活性。

2 实验设计

2.1 实验原理和目的

外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，是生命科学研究领域中最常用的细胞之一。PBMC的分离是免疫学研究中的一项基本技术，目前常用的PBMC 分离法有Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，用此法分离PBMC 纯度可达95%，其中淋巴细胞约占90%左右［5］。在传统方法分离PBMC基础上，进一步利用大型贵重仪器为本科实验教学服务，即采用研究级正置荧光显微镜和流式细胞仪分离鉴定各淋巴细胞亚群。

2.2 实验试剂和仪器

（1）实验试剂。FITC-Anti-Human CD3（eBioscience），FITC-Anti-Human CD4（eBioscience），PE-Anti-Human CD8（eBioscience），淋巴细胞分离液（达科为生物科技有限公司）等。正常人肝素抗凝全血2 ～4 mL／组（学生分5 组，学生自愿原则提供，深圳大学校医院协助）

（2）仪器耗材。流式细胞分析仪，台式冷冻离心机、正置荧光显微镜、移液器，吸管、载玻片等。

2.3 实验方法

（1）Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）。采用PBS 将抗凝血稀释1倍，吸取适量的淋巴细胞分层液置于离心管中，将稀释全血沿管壁缓慢加至分离液上（稀释后的血液与淋巴细胞分离液体积比为1 ∶1），保持两者界面清晰。2 000 r／min 离心10 min。沿管壁轻轻吸出PBMC 层细胞，PBS 洗涤及离心细胞，去除大部分混杂的血小板。取部分沉淀细胞即PBMC显微镜下观察拍照。

（2）人外周血CD3 淋巴细胞的显微镜观察。轻取上述PBMC 细胞，加入FITC-CD3 抗体室温孵育30 min，PBS洗涤2 次，最后一次离心后留部分液体，用加样枪吹打混匀，吸出1 点于玻片上，加盖玻片，在技术教师协助下荧光显微镜观察拍照。

（3）人外周血CD4-CD8 淋巴细胞亚群的流式检测。取流式管，设置好空白对照管、单阳管对照管及样品管，每管中加入抗凝血100 ～200 μL，单阳管中分别加入FITC-CD4 和PE-CD8 抗体（1∶1 000 稀释）一种抗体，而样品管中同时加入CD4 与CD8 两种抗体，混匀，室温孵育30 ～60 min，按比例加入红细胞裂解液裂解10 min，混匀，离心，PBS洗涤细胞，最后一次洗涤离心后定容至200 μL，样品交由专管技术教师流式细胞仪上机检测。

2.4 结果与分析

（1）密度梯度离心法分离PBMC及形态观察。离心前试管内有稀释血和淋巴细胞分离液两个层面，离心后试管内可见到有多个清晰层面，如图1（a）所示，从上到下依次为：血浆、单个核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。实验所取的为单个核细胞层，即上层黄色血浆和白色Percoll 分离液层交界处一圈的乳白色层面为PBMC层。

图1 外周血单个核细胞（PBMC）分析

该分离方法为传统经典的分离方法，PBMC 吸取出来，显微镜观察如图1（b）所示，可见视野中有大部分的淋巴细胞、少许红细胞、血小板等。

（2）CD3 免疫细胞的荧光显微镜观察。CD3 是所有T淋巴细胞膜上的共同标记，FITC-CD3 抗体可以特异性识别并结合T 淋巴细胞膜表面CD3 抗原结构分子。如图2 所示，在荧光显微镜的观察下，荧光标记清晰显示在T 淋巴细胞膜上，呈细小颗粒状绿色荧光。同一视野下，其余细胞（如粒细胞、红细胞、血小板等）没有荧光显示。

图2 CD3荧光显微镜观察示意图

（3）T淋巴细胞亚群的流式细胞仪鉴定。在使用流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群时，先利用散射光参数—前向角散射（FSC）和侧向散射（SSC）将细胞群区分出粒细胞、淋巴细胞、单核细胞［见图3（a）］。在该散点图上圈出所需分析的淋巴细胞群R1，图3（b）、（c）的散点图上显示的是R1 淋巴细胞群的具体结果，FSC-A代表细胞大小，FSC-W 代表细胞宽度，CD4-FICT代表CD4 淋巴细胞荧光强度，CD8-PE 代表CD8淋巴细胞荧光强度。最后通过计算机Cellquest 软件自动收集、数据获取及统计分析，得出各类阳性细胞的百分比率。图3（c）可以显示计算出CD4 和CD8 淋巴细胞亚群的数量多少。

CD3、CD4、CD8 淋巴细胞阳性比例在机体自身免疫、炎症和抗肿瘤等方面具有重要的意义［8］。根据T淋巴细胞亚群CD4 与CD8 的数据比例，可以推算出机体的免疫功能。正常情况下，CD4／CD8 比例介于1.5～2.5 之间，如果发生病毒感染，CD8 将增多，比值会发生变化，假如比例发生异常，代表机体免疫絮乱及功能异常。目前，在临床应用方面，可通过对不同的淋巴细胞亚群数量的测定来监测患者的免疫状态，并进行指导治疗［8-10］。

图3 不同散射光细胞参数散点图

3 教学效果分析与讨论

相较于传统的医学免疫学实验教学，本实验将教学与临床科研相结合，取得良好的教学效果，从以下几个方面体现出来。

3.1 利用大型贵重仪器，改革实验方法

传统免疫学实验是采用尼龙棉分离鉴定T 淋巴细胞［10-13］，与其相比，本实验教学紧跟最新发展的检测方法，将实验教学与医学院大型贵重仪器相结合［14-15］。实验教学中，利用研究级正置荧光显微镜观察CD3 淋巴细胞的形态，通过计算机实时观察图片及处理保存；采用流式细胞仪鉴定T 淋巴细胞亚群，加深了学生对免疫细胞、免疫功能的理解，其实践性方法特别为后续临床或基础研究具有重要意义。学生从细胞分离，提取细胞显微镜观察，流式鉴定细胞，亲自操作，整个实验过程具有连贯性，有利于学生形成完整的实验思路，有利于拓展科研创新思维和培养综合能力。研究级显微镜和流式细胞仪的应用，改革实验方法，能紧跟免疫学实验教学以及最新发展的实验技术。

3.2 合理安排实验时间

由于课时限制，以往大多数免疫学教学实验是由技术员事先完成大部分，学生按实验讲义指示完成剩余部分，或者一个完整的实验分成二次课完成。实验教学设计、实验课堂的开展具有连贯性。具体实施过程是以小组为单位，30 个学生分为5 组。实验课提前发实验方案讲义和仪器说明视频给学生，让学生课前提前查找相关资料，弥补课时不足，同时提高学生学习自主性。很多免疫反应或离心洗涤都需要一定的时间，在这些时间段，比如：在T淋巴细胞亚群抗原抗体反应的时候，学生可以利用这些时间完成PBMC 形态学观察、CD3 淋巴细胞荧光显微镜的观察。护士采血后学生小组实验自主安排进行，小组间实验交错进行，合理利用实验时间。最后，由大型贵重仪器设备专管老师协助检测样品。实验教学中，更新了实验小设备和实验耗材，比如：量程精确的微量移液器、孵育震荡箱、一次性枪头、一次性培养液等，从而大量节省实验时间。

3.3 改革实验内容，提高学生积极主动性

本实验课程对免疫细胞进行分离检测，经过实验操作，使学生容易对免疫系统、免疫细胞、免疫分子的结构与功能等抽象理论有更好的理解认识。传统免疫学实验课程以免疫凝集反应、免疫沉淀反应等示范性实验内容或玻片示教为主，操作性实验较少，且与实际临床结合较少［1-4，8-9］。实验设计以自愿为原则，课堂实验教学分5 组，每一组分派1 或2 位学生，由校医院专派护士抽取少许外周血作为测试的正常样品。在学生实验过程中，由于标本是学生自己的，都想看到实验结果，而实验结果好坏取决于操作者的每一个步骤。因此，实验课堂从开始到最后得出实验数据及数据分析，学生都呈现出极大的积极性，从而提高实验教学效果。本实验课程的内容在科研、临床上都具有较大实用价值，为学生今后进一步的临床或科研学习工作打下基础。

4 结 语

将实验课程内容与学科前沿技术相结合，在提高大型设备使用率的同时，学生不仅可以有目的性地消化医学免疫学相关理论基础知识，而且可以加深学生对免疫学新技术的认识和训练，激发学生的学习兴趣，为学生开展创新性实验研究和毕业论文奠定基础。随着科学研究的发展，免疫学实验技术应用越来越普遍，需要不断学习并进一步完善免疫学实验课的教学模式，提高教学效果，为学生今后开展临床科研工作打下基础。