LC-MS测定不同品种小麦中氨基酸含量及PCA分析

吴琴燕，朱建飞，陈宏州，杨红福，杨敬辉，庄义庆,2

(1.江苏丘陵地区镇江农业科学研究所中心实验室，江苏 句容 212400；2.江苏省农业科学院，江苏 南京 210049)

小麦属于禾本科植物，是世界第二大粮食作物，为人体主要蛋白的来源之一[1]。我国小麦籽粒平均蛋白含量约为15.10%，变异系数在7.50%～28.90%，不同品种间相差较大[2]，蛋白质的差异直接影响到小麦的氨基酸含量，而氨基酸组分及其含量的高低对机体生长和组织更新有重要的作用[3]，高蛋白含量的小麦育种，同时改善其必需氨基酸的比例是目前研究的热点[2]。对小麦氨基酸的研究多集中于水解氨基酸组分及其含量分析，研究者普遍认为水解氨基酸中谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸含量较高，而组氨酸、胱氨酸和蛋氨酸含量较低[4-5]，不同研究得到的特定氨基酸含量差异较大。目前用于测定氨基酸含量的常见方法有氨基酸自动分析仪分析法和液相色谱法[6-8]，这两种方法检测时间长、需要衍生，存在一定的局限性。液相色谱-串联质谱(LC-MS)检测氨基酸含量无需衍生，可在短时间内实现多种氨基酸的检测，是目前发展极为快速的方法[9-10]。

主成分分析(PCA)通过降维处理，可揭示组分和品种之间的复杂关系[11]，并可通过各主成分得分对样品进行综合评价[12-13]。利用PCA对食品品质的研究已经展开，李俊芳等[14]利用PCA对10个果桑品种游离氨基酸质量进行分析和评价，将复杂事务简单化。本研究中，笔者收集了淮南地区37个小麦品种，采用LC-MS技术测定其游离和水解氨基酸种类和含量，并通过PCA分析不同品种游离和水解氨基酸组成差异，以期为小麦的深加工利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

供试37个小麦品种于2018年收获于镇江农科院行香科研基地，分别为宁麦22、苏科麦1号、乐麦608、宁麦14、宁麦23、苏麦11号、扬麦16、镇麦12、龙麦169、望水白、苏麦188、华麦8号、扬麦23、宁麦0569、华麦5号、扬麦21、苏麦8号、农丰88、扬麦22、苏麦3号、镇麦168、扬麦13、扬辐麦5号、扬辐麦4号、淮麦30、扬麦15、宁麦26、华麦6号、宁资126、扬大180、华麦1028、扬麦27、扬辐麦1025、隆麦28、明麦133、扬麦158和扬麦28。小麦样品烘干粉碎后过250 μm筛网备用。

甲醇和乙腈(色谱纯)，美国默克公司；甲酸(≥98%)，德国CNW公司；盐酸(分析纯)，天津科密欧有限公司；L-谷氨酰胺(Gln)、L-赖氨酸(Lys)、γ-氨基丁酸(GABA)、L-精氨酸(Arg)、L-瓜氨酸(Cit)、L-谷氨酸(Glu)、L-鸟氨酸(Orn)、L-脯氨酸(Pro)、L-酪氨酸(Tyr)、L-丙氨酸(Ala)、L-天冬氨酸(Asp)、L-组氨酸(His)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-缬氨酸(Val)、L- 缬氨酸(Val)、L-色氨酸(Trp)、L-甘氨酸(Gly)(≥98%)，上海麦克林生化科技有限公司。

Agilent 1290型UPLC系统、ABsciex 4500质谱检测器、XP105DR型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；超纯水系统，默克公司；KQ-250E 型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 小麦样品前处理

游离氨基酸的提取[15]：准确称取小麦0.20 g，加入10 mL去离子水，沸水浴2 h后，离心取上清液，稀释100倍后，过0.22 μm微孔滤膜供上机测定使用。

水解氨基酸的提取[1]：准确称取小麦0.10 g，置于水解管中，加入6 mol/L的盐酸10 mL，100 ℃条件下水解24 h，水解完全后，冷却，混匀，离心，取上清液，稀释1 000倍后，过0.22 μm微孔滤膜供上机测定使用。

1.3 色谱-质谱条件

Phenomenex,KinetexHilic色谱柱 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B),60%A相等度洗脱4 min。流速为400 μL/min，柱温40 ℃，进样量1 μL。质谱检测条件：离子化模式ESI+，检测方式多反应监测(MRM)，气帘气35 psi，喷雾电压5.5 kV，离子化温度450 ℃；Gas1:40 psi，Gas2:40 psi。

采用ESI+模式，使用注射针泵分别向质谱中注入各个氨基酸溶液，通过一级全扫描和二级质谱裂解分析，分别获取各个氨基酸的母离子和子离子，并进一步优化去簇电压和碰撞电压，获得的19种氨基酸具体质谱检测条件如表1所示。

表1 19种氨基酸的多反应检测参数Table 1 Multiple reaction monitoringparameters of 19 amino acids

1.4 数据处理

每个样品重复测定3次，结果以平均值表示，采用SPSS17.0软件对试验数据进行处理。经过PCA提取出主成分进行综合评价，以每个主成分因子得分值Fi(i=1，2，…)及其方差贡献率βi(i=1，2，…)，作为权数，利用综合评价模型F=β1F1+β2F2+…+βiFi计算各样品综合得分[16-17]。

2 结果与讨论

2.1 氨基酸LC-MS检测方法的建立

按照1.3节色谱条件测定单体标准溶液，以各待测物质量浓度X(ng/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行回归分析，得到线性回归方程及相关系数。同时以19种氨基酸特征峰的信噪比(S/N)≥3时为该方法的检出限，(S/N)≥10为定量限，结果见表2。由表2可见：19种氨基酸在一定浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.982，检出限和定量限分别为1.29～29.45 ng/mL、4.13～165.90 ng/mL，说明该方法确实可行，可以满足样品测定的要求。

表2 19种氨基酸单体标准曲线、相关系数、线性范围、检出限和定量限Table 2 Calibration curves,LOD,and LQD of 19 amino acids

2.2 游离氨基酸含量分析

表3为37个小麦品种的游离氨基酸含量，其中Arg和Glu含量较高，Gly基本无检出。对37个品种的氨基酸含量进行主成分分析，结果见表4～5。由表4～5可知，前3个主成分的累计贡献率达到82.17%，说明前3个成分能代表该37个小麦品种中全部游离氨基酸的信息，能够较好地反映37个品种中游离氨基酸含量的相关关系。F1包括GABA、Arg、Gln、Lys、Glu、Pro、Tyr、Ala、Asp、His、Met、Phe、Thr和Val，其中Lys、Phe、Met、Thr和Val为必需氨基酸；F2与Orn、Ser、Gly具有较大正相关性，F3与Asp正相关，Cit高度负相关，这3个主成分能够较全面地反映所有化合物的信息。

表3 37种小麦游离氨基酸分析测试结果(n=3)Table 3 Contents of free amino acids in 37 different wheat varieties(n=3)

表4 游离氨基酸主成分特征值和贡献率Table 4 Eigenvalue of principal component and contribution rate of free amino acids

2.3 水解氨基酸含量分析

表6是37种小麦水解氨基酸分析测试结果。由表6可知，Gln、Trp在酸水解过程中被破坏，未检出，GABA酸解损失较大，其含量低于游离氨基酸。水解氨基酸中主要含有Glu、Pro、Tyr 和Asp，平均含量分别为52.99、17.54、11.55、12.46 mg/g；其次为Arg、Phe、Ser和Gly，平均含量分别为8.70、8.39、7.25和6.53 mg/g，其他氨基酸含量均较低。

表5 游离氨基酸主成分的成分矩阵Table 5 Principal component matric of free amino acids

表6 37种小麦水解氨基酸分析测试结果(n=3)Table 6 Contents of hydrolyzed amino acids in 37 different wheat varieties(n=3)

表7和表8为水解氨基酸主成分的特征值、百分率及成分矩阵。由表7和表8可知，F1与Arg、Lys、Glu、Pro、Tyr、Ala、Asp、His、Phe、Ser、Thr、Val、Gly相关性较大，F2中相关性最大的是Trp，其次为GABA，F3与Orn、Cit相关性较大，F4与Met相关性最大。前4个主成分的累计贡献率达到78.19%，代表了37个品种中水解氨基酸的大部分信息。

表7 水解氨基酸主成分的特征值及百分率Table 7 Eigenvalue of principal component and contribution rate of hydrolyzed amino acids

表8 水解氨基酸主成分的成分矩阵Table 8 Principal component matric of hydrolyzed amino acids

2.4 综合评价

游离和水解氨基酸的综合平均得分均为0，其综合评分大于0的品种分别如表9～10所示。由表9～10可知，扬辐麦5号、宁麦0569和扬麦28的游离氨基酸综合得分较大程度上超过其他品种，说明此3个品种游离氨基酸综合质量得分较高；扬大180的水解氨基酸综合得分较大程度超过其他品种，说明此品种水解氨基酸的综合质量较高。

表9 不同品种小麦游离氨基酸主成分因子和综合得分Table 9 Principal component factors and quality evaluation for wheat gains of different varieties in free amino acids

另外， 16个品种游离氨基酸综合质量得分高于平均水平，14个品种水解氨基酸的综合质量得分高于平均水平。扬辐麦5号、扬大180、扬麦13、镇麦168和望水白的游离和水解氨基酸综合得分均大于平均水平，为氨基酸品质较优的品种。

表10 不同品种小麦水解氨基酸主成分因子和综合得分Table 10 Principal component factors and quality evaluation for wheat gains of different varieties inhydrolyzed amino acids

3 结论与展望

建立了同时测定小麦中19种氨基酸的LC-MS方法，比较了37个小麦品种中游离和水解氨基酸含量的差异，通过PCA进行综合评价，发现各个氨基酸组分之间既相互独立又密切相关，游离氨基酸提取的3个主成分、水解氨基酸提取的4个主成分均反映了原变量的78.19%以上的信息，是评价小麦氨基酸的特征指标。37个品种中有16个品种游离氨基酸综合质量高于平均水平，14个品种水解氨基酸的综合质量高于平均水平，其中扬辐麦5号、扬大180、扬麦13、镇麦168和望水白的游离和水解氨基酸综合得分均大于平均水平，为氨基酸品质较优的品种。我国小麦品种较多，种植范围广泛，可以进一步加大样本量并结合其他营养成分进行综合分析，为选择优质品种提供更全面的理论依据。