乳腺癌转移灶标本FLOT1基因检测对早诊早治的意义

王雪铭 赵海军 杜倩倩 刘志勇 赵云峰 韩庆茹

乳腺癌是发生于乳腺上皮或导管上皮的恶性肿瘤，患者晚期转移常见于肺、肝、脑、骨等，其发生往往因为影响了重要器官功能[1]，需要病理活检才能进一步制定治疗方案。随着医学科学技术的进步，患者就医后的病理活检越来越精准，但挽救治疗效果并不很满意，所以，通过对转移灶给以病理分析，期望能找到更切合实际的乳腺癌早诊早治手段。近年来，对FLOT1基因在肿瘤的表达越来越被重视，已经发现，FLOT1基因在食管癌、肺癌、乳腺癌都有高表达[2]，而且，FLOT1基因的表达程度与癌症的生物学特性密切相关[3]，即表达程度高的患者，发生远处转移的几率也高，通过转染动物实验，FLOT1基因在肿瘤的早诊早治中可以指导临床采取措施[4]。乳腺癌患者晚期转移就医者，多已危及生命，采集的标本组织来源虽然不同，但其FLOT1基因蛋白表达具有共性，本文对标本的FLOT1基因研究进行报告。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年5月至2019年5月石家庄市第四医院的晚期乳腺癌患者病理标本96例(乳腺癌组)，患者均因晚期乳腺癌发生转移，在不同医院就医并进行病理活检而确诊，其中病理性骨折55例，肺转移呼吸困难26例，肝转移继发黄疸8例，其他7例。同时选取石家庄市第四医院和乐亭县医院良性乳腺肿瘤或者良性增生结节病理标本96例为空白对照组，患者均为女性，年龄33～75岁，平均年龄(51.2±14.3)岁；病程1～26周，平均(11.6±4.4)周。入组对象知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法 患者手术或穿刺活检，取得精准的病理标本或者蜡块。调阅病理切片或从蜡块取样，并与病理科合作，进行FLOT1基因检测，检测试剂由上海通蔚生物公司提供。此外，选择96例乳腺良性肿瘤或良性增生结节标本为空白对照组，给予FLOT1基因检测，进行分析对比。基因表达量检测采用Western 印迹法，即放射免疫沉淀法裂解液，提取切片细胞总蛋白，通过二喹啉甲酸法对蛋白定量，把上面蛋白(40 μg/每孔道)以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至聚偏氟乙烯膜，然后5%脱脂奶粉封闭转好的膜，1 h后洗膜，再加稀释好的一抗，在4℃条件下摇床孵育过夜，再洗膜后加1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，先室温孵育，1 h后再洗膜，此时电化学发光显影、定影。经过化学发光成像系统及配套的软件采集图像。实验重复3次。

1.3 评价指标

1.3.1 FLOT1基因检测阳性强度：以荧光定量强度(单位AU)分析。

1.3.2 FLOT1基因检测阳性率：FLOT1基因检测阴性计1分；FLOT1基因检测弱阳性(+)计2分；FLOT1基因检测阳性(++)计3分；FLOT1基因检测强阳性(+++)计4分。FLOT1基因检测阳性率=FLOT1基因检测阳性(++)例数+ FLOT1基因检测阳性(+++)例数/总例数。

2 结果

2.1 2组标本FLOT1基因检测阳性强度比较 乳腺癌转移灶标本FLOT1基因检测阳性强度显著高于乳腺良性肿瘤或良性结节标本，差异有统计学意义(P<0.001)。见表1，图1。

表1 乳腺癌转移灶标本和乳腺良性肿瘤或良性结节标本FLOT1基因检测阳性强度比较

图1 上面是乳腺良性肿瘤或良性结节标本FLOT1基因蛋白定量，下面是乳腺癌转移灶标本FLOT1基因蛋白定量

2.2 乳腺癌转移灶标本FLOT1基因检测阳性率与乳腺良性肿瘤或良性结节标本阳性率比较 乳腺癌转移灶标本FLOT1基因检测阳性率为97.92%显著高于乳腺良性肿瘤或良性结节标本阳性率43.75%，差异有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 乳腺癌转移灶标本FLOT1基因检测阳性率与乳腺良性肿瘤或良性结节标本阳性率比较 n=96，例(%)

3 讨论

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一，发病率呈现上升趋势[4]。究其原因，主要还是早期发现、早期诊断、早期治疗的方法不够高级，特别是乳腺癌只有发生转移才是多数患者死亡的原因[5]，但对乳腺癌发生转移的机制一直不清楚。最近，从基因研究进行乳腺癌的早诊早治研究成为突破降低乳腺癌死亡率瓶颈的研究热点[6]。实际上，BRCA基因检测已经逐渐普及，通过对易感人群进行BRCA基因检测可以预测患乳腺癌的风险，但基因检测的广泛应用，不仅是筛查，通过对不同对象、不同组织的基因检测，也可以指导选择正确的治疗方法，正确的选择药物等[7]。目前，从基因水平进行肿瘤早诊早治已经取得了重大进步，世界范围内基因诊治各类肿瘤的实验方案可谓层出不穷，而乳腺癌的基因诊治也逐渐广泛应用于临床，随着新的分子学技术的发展和分子免疫学理论的不断完善，很多新的基因诊治手段会用于乳腺癌[8]，而许多诊治乳腺癌的基因不断被克隆成功，为乳腺癌的早诊早治提供安全、高效、特异的转导系统。有学者跟随着对乳腺癌疾病的基因启动与基因调控的研究的深入，对导入的乳腺癌基因的定位和表达程度得到了更好的控制[9]。通过这些不懈的努力，乳腺癌基因水平的早诊早治越来越前景广阔。

脂筏结构蛋白在生物体中广泛存在，且高度保守，参与细胞黏附、多种信号通路、轴突生长、跨膜转运等，包含两种同源亚型，即脂筏结构蛋白1(Flotillin-1，FLOT1)和脂筏结构蛋白2(Flotillin-2，FLOT2)。研究表明，多种肿瘤中FLOT1表达上调，如食管癌、肺癌、乳腺癌等，其表达与肿瘤进展、预后等密切相关[10]。也有研究指出，抑制FLOT1表达可降低乳腺癌细胞生长，如m iR-124可靶向抑制FLOT1降低乳腺癌细胞的增殖及迁移能力；敲除FLOT1可降低乳腺癌细胞的增殖及成瘤能力。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术是一种在转录后抑制基因表达的新技术[11]，能高效、特异的抑制目的基因表达，已成为病毒性疾病和肿瘤治疗、基因功能研究等的有力工具。通过研究对FLOT1基因靶向抑制的作用机制，探讨乳腺癌早诊早治的相关方案，可以更好的为提高乳腺癌早诊早治水平作出贡献。

研究表明，FLOT1在乳腺癌细胞高表达，通过RNA干扰抑制其表达可诱导癌细胞凋亡，机制与下调STAT3信号通路有关[12,13]。探讨FLOT1基因在乳腺癌细胞表达及靶向抑制其表达对癌细胞凋亡的影响及机制，从而取得对乳腺癌早诊早治的研究方向，成为各基因公司和临床医师研究的热点。有研究表明，FLOT-1在乳腺癌、食管鳞状癌、肾细胞癌、移行细胞癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌等肿瘤中均高表达,并与临床分期、转移、浸润和预后相关[14]，通过统计分析,发现胃癌组织FLOT1 m RNA表达水平高于癌旁组织,在浸润深度T3+T4、淋巴结转移阳性(N 1～3)和AJCC临床分期Ⅲ+Ⅳ亚组中,FLOT1蛋白高表达胃癌患者的5年生存率均明显低于低表达患者。

有研究对FLOT在细胞的增殖、凋亡、运动、黏附等众多生物学进程中发挥重要作用给以越来越多的研究[15]，多种肿瘤中FLOT表达上调，影响肿瘤发生发展，作为细胞膜脂筏的一个主要结构蛋白，FLOT1与细胞黏附、细胞内吞、细胞的信号传导等存在密切关系，主要通过将各种细胞信号通路的胞膜受体锚定在细胞膜上发挥信号传导媒介的作用。研究发现，多种肿瘤中FLOT1出现异常表达，乳腺癌中FLOT1表达也明显增强，与肿瘤分期、远处转移等临床病理特征显著相关[16]，下调FLOT1表达可抑制乳腺癌细胞增殖。而目前关于FLOT1对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制研究的尚未明确。研究显示，FLOT1在作为人卵巢癌生物标志物中的应用，本发明首次证实了通过检测人血清FLOT1水平可以诊断卵巢癌，表明FLOT1可作为卵巢癌有效的生物标志物，诊断价值很高；还证实了使用FLOT1联合CA125诊断，可将卵巢癌的诊断率提高24%[17]。提示用于检测血清FLOT1水平的试剂可用于制备诊断卵巢癌的试剂或试剂盒，同时含有检测血清FLOT1和CA125水平试剂的试剂盒能够显著提高卵巢癌的诊断率。

综上所述，乳腺癌病理标本FLOT1基因检测阳性强度与阳性率均显著高于乳腺良性肿瘤和良性增生结节，提示临床采集的乳腺肿瘤标本进行常规FLOT1基因检测，对强阳性的病例，虽然病理为良性肿瘤，仍应视为乳腺癌发病的高风险因素，并积极给出预防措施。