雷公藤多苷通过Akt/mTOR信号通路对糖尿病肾病小鼠肾损伤的影响

常帅 徐晓琴 相华 孟伟 郑海燕 张辉 荣景 周洪 夏菊梅

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)为糖尿病(diabetes mellitus，DM)主要慢性并发症之一，国际糖尿病联盟称，全世界死亡人数中约有10.7%是DM所造成的，目前全世界范围内患DM的成人数量高达4.25亿[1]。2013年国内一项报道显示，我国成人DM患病率是10.4%，其中20%～40%患者发生了DN[2]。当前，伴随人们生活水平的提升，国内DM患者逐渐呈现出年轻化趋势，临床对防治DN已刻不容缓。DN病因病机异常复杂，西医多进行降压、降糖等综合疗法，而中医由整体出发，天人合一作为基础理论，经过中药的多途径、多靶点和多部位对全身内分泌代谢进行调节[3,4]。雷公藤多苷为单味中药雷公藤的提取物，具有“活血通络、祛风除湿”等功效[5]，雷公藤多苷对于前期DN患者的临床疗效已得到认可，但关于其治疗机制的相关研究笔者所见较少。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)为丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，DN病理改变和PI3K/Akt/mTOR信号通路活性联系紧密，调控肾小球固有细胞、系膜细胞等增殖与生长，对介导细胞外基质蛋白合成等有重要影响[6,7]。因此，本研究分析雷公藤多苷通过Akt/mTOR信号通路对DN小鼠肾损伤影响，为临床患者治疗提供一些实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验小鼠 选取SPF级C57 BL/6 J小鼠75只，购自北京维通利华实验动物公司，许可证号：SCXK(京)：2019-31，体重15～25 g，平均(19.20±3.14)g。常规饲养1周后开始实验，小鼠分笼饲养，每个笼内5只，室温维持22℃～26℃，相对湿度55%～65%，昼夜循环，保持12 h光照，小鼠灌胃、添加饲料及换水均有专人进行。

1.2 实验药物、试剂与仪器 药物、试剂：雷公藤多苷(江苏泰州美通制药公司)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，糖化血清蛋白、尿蛋白、血尿素氮及血清肌酐试剂盒(购自南京建生物研究所)，兔抗鼠p-mTOR多克隆抗体、兔抗鼠mTOR多克隆抗体(美国bioworld公司)，兔抗鼠p-Akt多克隆抗体、兔抗鼠Akt多克隆抗体(美国SAB公司)。仪器：冷冻离心机(型号：5430R，德国Eppendof公司)，台式离心机(型号：TDL-40B，上海安亭科学仪器)，电泳仪(型号：164-5051，美国Bio-Rad公司)，电子天平(型号：AB135-S，瑞士Mettler Toledo公司)，全自动酶标仪(美国Thermo公司)，旋转蒸发仪(型号：LY202B，上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 方法 按随机数字表法将小鼠分成5组，分别为对照组、模型组、雷公藤多苷低剂量组、雷公藤多苷中剂量组和雷公藤多苷高剂量组，每组15只。除对照组外，其他4组小鼠制备DN模型，采用高糖高脂饲料(73.8%基础饲料、10%蛋黄粉、0.2%胆盐、10%蔗糖、1%胆固醇、5%猪油)喂养4周，将剂量为120 mg/kg的STZ(pH值4.4柠檬酸钠缓冲液配制)一次性注入小鼠腹腔内，3 d、5 d及7 d后小鼠禁食但不禁水12 h，剪尾检测其空腹血糖(FBG)含量，同时采集小鼠24 h尿液，若小鼠FBG≥11.0 mmol/L，同时持续发生蛋白尿则说明成功造模。造模后第2天起，依据人和动物剂量转换公式，雷公藤多苷低、中、高剂量组分别灌胃剂量为25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的雷公藤多苷悬浊液(10 mg雷公藤多苷溶于1 ml蒸馏水内，配置浓度是10 g/L)，对照组和模型组灌胃等剂量0.9%氯化钠溶液，5组小鼠均连续灌胃8周。

1.4 观察指标 (1)一般状况：记录5组小鼠尿量、死亡只数、饮水、饮食、精神情况、皮毛色泽及活动状况等。(2)小鼠体重、左肾重和相对肾重：末次给药后，称取5组小鼠体重，断颈处死后将左侧肾脏切取，放置在0.9%氯化钠溶液内浸洗、滤纸吸干后精确称重，计算小鼠相对肾重(KW/BW)。(3)肾脏病理学观察：小鼠肾脏称重后缓冲液冲洗，10%甲醛固定，而后行乙醇梯度脱水、透明，石蜡包埋后切片，厚度为4 μm，常规行HE染色，在光镜下观察5组小鼠肾脏组织病理形态。(4)小鼠生化指标情况：采集小鼠腹腔静脉血4 ml，Hitachi7060全自动生化分析仪检测三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量，血糖仪检测小鼠FBG含量，糖化血清蛋白、总尿蛋白、血清尿素氮和血清肌酐含量检测均依据试剂盒说明书进行。(5)qRT-PCR检测5组小鼠肾脏组织mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt mRNA表达：Trizol消化5组小鼠肾脏组织细胞，mTOR上游引物5’-GTAGTATAGTAGTAGTATA-3’，下游引物5’-GATA

CTACTAGTAGTATGT-3’；p-mTOR上游引物5’-GTAT

AGTACTAGTAGTAGA-3’，下游引物5’-GGTAGTAGC

AGTCGTAGTA-3’；Akt上游引物5’-GAGCGTAGCTAG

CTATCAC-3’，下游引物5’-GCATCAGTCAGCTAGCTA

C-3’；p-Akt上游引物5’-GCATGCATCGATCAGTCAG-3’，下游引物5’-GCATCAGTCAGCTAGTCAG-3’；内参β-actin上游引物5’-GTACTAGTCGTAGCAGTAG-3’，下游引物5’-GCTAGTCAGTCAGCTAGCT-3’，扩增片段479 bp。PCR反应条件：92℃ 40 s，55℃ 450 s，74℃ 70 s，循环40次后取mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt mRNA循环阈值(Ct)，ΔΔCt(ΔΔCt=Ct目的基因-△Ct内参基因)分析，计算2-ΔΔCt目的基因相对表达量。(6)Western-blot检测5组小鼠肾脏组织内mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt蛋白表达：常规提取5组小鼠肾脏组织细胞总蛋白，上样电泳，80 V电压，溴酚蓝染料至分离胶提高电压为100 V，分离胶下泳出溴酚蓝结束电泳。PVDF膜内进行蛋白质电转移，30 mA恒流，持续80 min。5%TBST脱脂奶粉封闭PVDF膜，震荡50 min。封闭结束后洗膜3次，10 min/次，膜移至杂交袋，置入漂洗液稀释抗体，孵育过夜。洗膜3次，10 min/次，置入过氧化物酶标记二抗，震荡50 min。ECL显色液中将PVDF膜温育6 min，依次曝光、显影、定影。清水冲洗，晾干扫描，IPP软件对扫描图像目的条带行灰度分析。

2 结果

2.1 5组小鼠一般状况 对照组小鼠无死亡，饮食、饮水及尿量正常，活泼好动，皮毛有光泽；模型组死亡3只，出现明显多饮多食症状，毛发无光泽、枯槁，活动量明显下降；雷公藤多苷低、中、高剂量组死亡小鼠分别为2只、2只、1只，小鼠多饮、多食状况较模型组显著好转，毛发有光泽，活动量较模型组增加。

2.2 5组小鼠体重、左肾重和相对肾重情况比较 模型组小鼠体重较对照组降低，左肾重、相对肾重较对照组升高；雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠体重较模型组升高，左肾重、相对肾重较模型组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 5组小鼠体重、左肾重和相对肾重情况比较

2.3 5组小鼠肾脏病理形态情况 对照组小鼠肾脏形态无异常，肾小管、肾小球结构正常，没有炎性渗出物，髓质与皮质边界清楚，间质内没有纤维组织增生；模型组小鼠肾小球系膜细胞增生明显，有大量的红细胞渗出，部分肾小管坏死，间质中有淋巴细胞浸润，部分上皮细胞胞质嗜酸性变强；雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠肾小球系膜细胞增生，少部分肾小管出现坏死、变性，病理受损程度好于模型组。见图1。

2.4 5组小鼠血脂含量情况比较 模型组小鼠血清TC、TG、LDL含量较对照组升高，HDL含量较对照组降低；雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠血清TC、TG、LDL含量较模型组降低，HDL含量较模型组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 5组小鼠血脂含量比较

2.5 5组小鼠肾功能指标和血糖情况比较 模型组小鼠血清糖化血清蛋白、尿素氮、肌酐、FBG含量及总尿蛋白较对照组升高；雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠血清蛋白、尿素氮、肌酐、FBG含量及总尿蛋白较模型组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 5组小鼠肾功能和血糖情况比较

2.6 5组小鼠肾脏组织mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt mRNA相对表达量比较 模型组小鼠肾脏组织p-mTOR、p-Akt mRNA相对表达量较对照组升高；雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠肾脏组织p-mTOR、p-Akt mRNA相对表达量较模型组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 5组小鼠肾脏组织mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt mRNA相对表达量比较

2.7 5组小鼠肾脏组织mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt蛋白表达情况比较 模型组小鼠肾脏组织p-mTOR、p-Akt蛋白表达较对照组明显升高(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠肾脏组织p-mTOR、p-Akt蛋白表达较模型组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 5组小鼠肾脏组织mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt蛋白表达情况比较

3 讨论

DN的实质为糖尿病肾小球硬化症，患者前期仅表现是尿微量白蛋白排泄增多，伴随病情的发展会进入DN临床期，表现出水肿、高血压、大量蛋白尿等症状，若不进行及时有效地诊疗，则可成为终末期肾衰竭，导致机体多器官受损，最终导致患者死亡[8-10]。当前，关于DN发病机制尚未完全明确，西医治疗主要为降压、降糖等对症疗法，无阻断或者逆转DN进展的有效措施。

祖国医学中没有关于DN的专名，但依据其临床表征可归于“尿浊”、“肾消”、“水肿”等范畴内，其病机在消渴病“燥热偏盛、阴津亏耗”基础上，由于燥热而耗气伤津，导致气阴两虚，而阴损及阳，患者阴阳俱损。正虚之处，乃容邪之所，机体内病理产物痰湿、血淤及气滞等互相胶结，在肾之脉络聚集，导致肾气不固，而精微外泄。当前，多数学者认为DN主要病机为“瘀阻肾络”，张永杰等[11]认为DN病理特征是瘀阻脉络，造成气机受阻，脏腑受损；潘满立等[12]认为DN患者长时间造成血行不顺畅，肾络受阻而成瘀。雷公藤多苷为单味中药雷公藤的提取物，具有“活血通络、祛风除湿”等功效。现代药理显示，雷公藤多苷可对肾脏内巨噬细胞的活化和浸润抑制，还可抑制VEGF mRNA表达，降低血清炎性因子含量，对系膜细胞系膜基质增殖抑制，进而起到肾脏保护作用[13,14]。

机体内处于高血糖条件，可形成过量结构更稳定终末期糖基化产物，结合终末期糖基化产物受体RAGE可导致一系列状态异常生命反应进程，还可加速系膜细胞和基底膜细胞的肥大与增殖，随着体内炎症损害程度加重，可使终末期肾衰竭进程加快[15-17]。本研究显示，模型组小鼠血清糖化血清蛋白、尿素氮、肌酐、FBG含量及总尿蛋白较对照组升高；雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠血清蛋白、尿素氮、肌酐、FBG含量及总尿蛋白较模型组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明雷公藤多苷可有效改善DN大鼠肾功能和肾脏的病理状态。

mTOR产生了2个功能与结构都不相同蛋白复合物，分别是mTORC1与mTORC2，在Akt/mTOR信号路径转导中主要是mTORC1参加，同时发挥了重要影响[18]。机体内能量水平、营养物质及胰岛素等各类生长因子等信号出现改变以后，mTORC1能够加速下游4E-BP1、S6K1磷酸化，从而对能量代谢、mRNA翻译、细胞周期进展和蛋白质合成等进行调节，在细胞分化、生长和增殖等进程中有关键性作用。mTOR位于PI3K/PKB下游，所以构成了PI3K/PKB/mTOR路径，PKB为反转录病毒Akt-8内V-akt编码蛋白产物，因此还可称为Akt。不同细胞因子影响下，活化PI3K后可形成三位磷酸化磷脂产物导致Akt和膜结合，在PDK影响下，PKB内丝氨酸残基与苏氨酸出现磷酸化而进入到胞核与胞质内，经结节性硬化复合体(TSC)将mTOR蛋白激活，对下游的效应分子4E-BP1与S6K1表达调节，从而调节细胞周期改变和细胞的增殖与生长。在高糖影响下，激活了肾脏内细胞表型PI3K/Akt、mTOR信号路径，导致外基质积聚、系膜细胞肥大增殖和血管平滑肌增殖，加速DN病情发展。本文研究显示，模型组小鼠肾脏组织p-mTOR、p-Akt蛋白与mRNA表达较对照组升高；雷公藤多苷低、中、高剂量组小鼠肾脏组织p-mTOR、p-Akt蛋白与mRNA表达较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明雷公藤多苷可抑制DN小鼠Akt/mTOR信号通路活化。

综上所述，雷公藤多苷可有效改善糖尿病肾病小鼠肾损伤情况，其作用机制可能和抑制Akt/mTOR信号通路活化有关。