清肺化痰颗粒对慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠的保护作用

王妍 李晓 徐莹 张俐

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一种以不完全可逆的气流受限为特征的气管、支气管和肺组织炎症性疾病[1]，为临床常见多发病，在我国中老年人群中发病率约为8.2%[2]。COPD病程久、预后差、可反复发作，急性加重时会导致患者肺气管及支气管炎性反应爆发、气道粘液高分泌，进而严重影响患者肺功能，严重时可引起全身各器官损害，并导致死亡[3]。清肺化痰颗粒是由经验方“清肺化痰汤”依据中医药理论而制成的颗粒合剂[4]，研究表明，清肺化痰汤是由桑白皮、黄芩、瓜萎壳等组成的中药方剂，可祛痰、解热、平喘，能用于治疗COPD[5]；还能有效改善COPD急性加重期患者血液流变性，降低肺部炎性反应、修复肺功能，具有良好的临床治疗效果，且安全性良好[6]，但其作用机制目前还不清楚。NLRP3是组成炎性小体复合物的重要成分，激活炎性小体可使pro-caspase-1裂解为 caspase-1，参与并介导机体多种炎性反应[7]；臭氧诱导的肺部炎症中NLRP3炎症小体被激活，下调NLRP3表达可减轻炎症导致的肺损伤[8]；NLRP3炎性小体还参与COPD患者的机体炎性反应，急性加重期COPD患者外周血单个核细胞中NLRP3、IL-18和 IL-1β表达水平高于稳定期患者及健康人[9]，表明NLRP3炎症小体信号是治疗肺部炎症的一个分子靶点，可能是清肺化痰颗粒治疗COPD急性加重期的作用机制。本文通过使用NLRP3炎性小体抑制剂处理COPD急性加重期大鼠，探讨清肺化痰颗粒对COPD急性加重期大鼠的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:SPF级SD大鼠60只购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXX(豫)2015-0003，雌雄各半，在清洁、安静、通风良好的条件下饲养，自然光照，定时更换垫料、清理、消毒鼠笼，自由饮食、饮水、活动，温度保持在25℃左右，相对湿度保持在约50%，噪音保持在约80分贝，氨浓度<20 mg/L。

1.1.2 主要试剂与仪器:清肺化痰颗粒购自北京长城制药厂，生产批号：Z11020039，每包9 g；VX-765购自美国Selleck生物科技有限公司，货号：S2228；GAPDH、NLRP3、caspase-1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；大前门牌香烟购自上海卷烟厂，焦油含量11 mg/支；大鼠IL-18、IL-1β ELISA试剂盒、兔源GAPDH、NLRP3、caspase-1一抗、羊抗兔二抗购自美国Abcam公司，货号分别为：ab213909、ab100768、ab181602、ab232401、ab179515、ab150077；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、TBST缓冲液、LPS购自北京索莱宝公司，货号分别为：P1200、T1081、L8880；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司，货号分别为：9108、RR037Q/A/B、639519；RIPA裂解液购自上海碧云天公司、BCA试剂盒、HE染色试剂盒，货号分别为：P0013K、P0011、C0105等。酶标仪(美国Perkin Elmer公司，型号：Elx800)；蛋白电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司，型号分别为：Mini PROTEAN)；全身体积描记法无创非束缚小动物肺功能测量仪(法国EMKA公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf股份公司，型号：Centrifuge 5424R)；轮转切片机、包埋机、烤片机(德国 Leica 公司，型号分别为：RM2035、EG1160、HI1220)；倒置显微镜(日本Olympus公司，型号：1X70)；电子天平(德国Sartorius 公司，型号：BSA224S-CW)；自制烟熏箱(由熏蒸灭菌箱改造而成，箱体尺寸为60 cm×60 cm×70 cm)等。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及分组给药:参照文献[10]方法制备模型：以0.9%氯化钠溶液溶解LPS配制为1 g/L 的溶液备用，将SD大鼠放置在自制的烟熏箱中烟熏，每次放入10只大鼠，点燃8支香烟，每天烟熏30 min，持续30 d，并在第1、14、28天做气管插管并经气道滴注2 ml LPS溶液，气道滴注当日不进行烟熏。观察大鼠生理活动，出现精神不振、食欲减退、反应迟钝、咳嗽气喘、毛色灰黄凌乱、呼吸急促、肺部听诊出现杂音等症状，取其肺组织进行HE染色，观察其病理改变，出现肺组织气管黏膜水肿充血、肺泡结构被破坏，融合面积扩大、炎性细胞浸润等肺损伤症状，表示造模成功[11]。共造模48只，分为模型组、清肺化痰颗粒组、VX-765组、清肺化痰颗粒+ VX-765组4组，每组12只。取12只大鼠气管插管并经气道滴注0.9%氯化钠溶液作为假手术组。清肺化痰颗粒用0.9%氯化钠溶液稀释配制成浓度0.1 g/ml溶液待用，清肺化痰颗粒组、清肺化痰颗粒+ VX-765组于每日上午9∶00以10 ml/kg的剂量灌胃[12]；VX-765溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，VX-765组、清肺化痰颗粒+ VX-765组于每日上午9∶00以50 mg/kg剂量腹腔注射[13]，清肺化痰颗粒组于每日上午9∶00同体积腹腔注射DMSO，VX-765组于每日上午9∶00以等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，模型组和假手术组于每日上午9∶00同体积腹腔注射DMSO并以等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，持续7 d。

1.2.2 肺功能指标测定:所有大鼠末次给药结束24 h后放入体描箱，将生理信号遥测发射盒置于体描箱底部，同时调整监测条件为：气泵流量2 L/min，传感器放大倍数500，采样率200 Hz，输入校准-50，当有效波形达到90%时记录不同时间的呼吸参数，采用小动物生理信号遥测分析系统记录数据并以小动物肺功能软件分析得出肺功能指标包括呼吸频率(frequency，f)、潮气量(tidal volume，VT)、每分通气量(minute ventilation，MV)、呼气峰流值(peak expiratory flow，PEF)、吸气阻力(resistance inspiratory，Ri)。

1.2.3 标本采集及大鼠肺组织损伤情况检测:所有大鼠末次给药结束24 h后，以40 mg/kg的剂量腹腔注射4%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，将其以仰卧位固定在操作台上，解剖并暴露双肺、气管、股动脉，剪断股动脉放血，并在气管下段剪一小口插入2 ml注射器针头，以手术线结扎固定、注射器缓慢注入1 ml 0.9%氯化钠溶液，当大鼠左肺逐渐变得膨隆、苍白时缓慢回抽灌洗液，然后再将液体缓缓注回肺内，如此反复3次。收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid，BALF)3 ml，转移至10 ml灭菌离心管中，4 000 r/min、4℃离心5 min，取上清储存在-80℃冰箱中备用。开胸取出肺组织，剪取约1 g储存于-80℃中备用；其余肺组织以0.9%氯化钠溶液漂洗，经固定、梯度乙醇(从低到高)脱水、透明后以石蜡包埋，采用切片机做病理切片，经脱蜡、梯度酒精(从高到低)浸泡后，HE染色试剂盒染色，具体按照说明书进行操作，然后以蒸馏水漂洗、再次脱水、二甲苯透明后封片，在光学显微镜下观察肺组织病理改变情况并拍照，根据损伤严重程度做Holfbauer[14]。见表1。

表1 Holfbauer病理评分标准

1.2.4 BALF中IL-18、IL-1β水平测定:取1.2.3中的BALF 4℃下解冻，采用ELISA试剂盒测定BALF中IL-18、IL-1β水平，具体按照说明书进行操作。

1.2.5 肺组织中NLRP3、caspase-1表达水平的检测

1.2.5.1 qRT-PCR检测NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平，取约0.5 g 1.2.3中的冻存的肺组织剪碎，加入RNAiso Plus并参照其说明书的步骤提取总RNA，采用逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA后，以荧光定量PCR试剂盒后进行荧光定量PCR反应，反应体系的配制、反应条件的设定按照说明书进行操作，以GADPH为内参基因，qRT-PCR引物序列见表2，2-ΔΔCt算法对数据进行分析。见表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.5.2 免疫印迹实验检测NLRP3、caspase-1蛋白表达水平，取约0.5 g 1.2.3中的冻存的肺组织剪碎，加入预冷的蛋白裂解液(添加蛋白酶抑制剂)混匀，匀浆机制备为匀浆液， 3 000 r/min，4℃离心20 min，取上清液转移至干净的Ep管中，即为总蛋白，做好标记，以BCA试剂盒测定5组样品总蛋白浓度，根据结果5组分别取相同质量的蛋白样品，以电泳仪进行SDS-PAGE电泳，使用转膜仪转移全部分离的蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)上，根据目的蛋白分子量截取蛋白条带置于小盒中，室温以5%的脱脂奶粉封闭2 h，分别加入相应一抗4℃孵育过夜，TBST溶液漂洗3次，室温孵育羊抗兔二抗2 h，TBST漂洗3次，以化学发光试剂显色，Tanon软件拍摄图像并分析蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 5组大鼠肺功能比较 与假手术组比较，模型组大鼠VT、Ri显著升高(P<0.05)，f、MV、PEF显著降低(P<0.05)；与模型组比较，清肺化痰颗粒组、VX-765组、清肺化痰颗粒+VX-765组大鼠VT、Ri均降低(P<0.05)，f、MV、PEF均升高(P<0.05)；与清肺化痰颗粒组及VX-765组分别比较，清肺化痰颗粒+ VX-765组大鼠VT、Ri均降低(P<0.05)，f、MV、PEF均升高(P<0.05)。见表3。

表3 5组大鼠肺功能比较

2.2 5组大鼠肺组织损伤情况比较 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织气管黏膜水肿充血、肺泡结构被破坏，融合面积扩大、炎性细胞浸润等肺损伤症状，Holfbauer评分显著升高(P<0.05)；与模型组比较，清肺化痰颗粒组、VX-765组、清肺化痰颗粒+VX-765组大鼠病理损伤症状减轻，Holfbauer评分均降低(P<0.05)；与清肺化痰颗粒组及VX-765组分别比较，清肺化痰颗粒+ VX-765组大鼠病理损伤症状进一步减轻，Holfbauer评分均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表4。

表4 5组大鼠肺组织Holfbauer评分 n=12,分,

2.3 5组大鼠BALF中IL-18、IL-1β比较 与假手术组比较，模型组大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，清肺化痰颗粒组、VX-765组、清肺化痰颗粒+VX-765组大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平均降低(P<0.05)；与清肺化痰颗粒组和VX-765组比较，清肺化痰颗粒+ VX-765组大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平均降低(P<0.05)。见表5。

表5 5组大鼠BALF中IL-18、IL-1β比较

2.4 5组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1 mRNA表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1 mRNA相对表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，清肺化痰颗粒组、VX-765组、清肺化痰颗粒+VX-765组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1 mRNA相对表达均降低(P<0.05)；与清肺化痰颗粒组和VX-765组比较，清肺化痰颗粒+ VX-765组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1 mRNA相对表达均降低(P<0.05)。见表6。

表6 5组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1 mRNA相对表达

2.5 5组大鼠NLRP3、caspase-1蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1蛋白相对表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，清肺化痰颗粒组、VX-765组、清肺化痰颗粒+VX-765组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1蛋白相对表达均降低(P<0.05)；与清肺化痰颗粒组和VX-765组比较，清肺化痰颗粒+ VX-765组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1蛋白相对表达均降低(P<0.05)。见图2，表7。

表7 5组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1蛋白相对表达比较

图2 免疫印迹检测5组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1蛋白表达；A 假手术组；B 模型组；C 清肺化痰颗粒(1 g/kg)组；D VX-765(50 mg/kg)组；E 清肺化痰颗粒+VX-765(剂量分别为1 g/kg，50 mg/kg)组

3 讨论

近年来COPD的发病率逐年上升，已成为世界范围内的主要慢性疾病，具有较高的致病率、死亡率，全球每年约600万人死于COPD，是疾病致死原因的第四位，预计到2020年，将成为全球第三大死亡原因[15]。当其急性发作时，患者肺组织气管黏膜水肿充血、肺泡结构大量被破坏并融合、炎性细胞浸润呼吸道，大量分泌粘液，使患者呼吸困难，严重威胁患者身心健康、影响生活质量，给患者家庭造成沉重的经济负担，治疗COPD成为当前的临床热点之一，因此本研究具有重要的社会价值及临床意义[16]。COPD的发病机制目前尚不十分明确，目前公认最主要病因是吸烟，烟草燃烧产生的大量有毒物质能够促使肺组织中的巨噬细胞、呼吸系统上皮细胞释放IL-18、IL-1β等炎性因子，使中性粒细胞透过肺泡毛细血管募集至肺部引起炎性反应，导致肺组织发生病理性改变，进而造成大量组织损伤，促进COPD发生发展[17]。本研究采用气道滴注LPS溶液加烟熏的方法建立慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠模型；由结果可知，相比假手术组，模型组大鼠出现气管黏膜水肿充血、肺泡结构被破坏，融合面积扩大、炎性细胞浸润等肺损伤症状， Holfbauer评分，肺功能指标VT、Ri显著升高，肺功能指标f、MV、PEF显著降低，表明模型大鼠肺部出现炎性反应，肺功能受损，模型制备成功。

研究表明，清肺化痰汤能有效治疗急性加重期慢性阻塞性肺疾病，改善患者的临床症状[18]，但其药理机制目前并不十分清楚，研究发现当NLRP3/caspase-1信号被激活时，可促进免疫细胞合成并分泌大量IL-1β、IL-18，作用于其受体IL-1R 及 IL-18R，触发NF-κB依赖的一系列信号，引起严重的炎性反应[19]， 其还参与调节COPD的发生及疾病的进展，急性加重期COPD患者肺组织中NALP3炎症小体被激活，NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β表达相比稳定期COPD患者显著升高，稳定期COPD患者NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β表达相比健康人显著升高[20]，推测下调NLRP3/caspase-1信号可能是清肺化痰颗粒治疗急性加重期慢性阻塞性肺疾病的药理机制。本研究采用腹腔注射NLRP3炎性小体抑制剂VX-765处理慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠，结果显示，经过清肺化痰颗粒及VX-765处理的大鼠病理损伤症状均减轻，Holfbauer评分、肺功能指标VT、Ri，BALF中IL-18及IL-1β水平，肺组织中NLRP3及caspase-1表达均降低，肺功能指标f、MV、PEF均升高，表明下调NLRP3/caspase-1信号和清肺化痰颗粒作用类似，均可减轻肺部炎性反应、修复肺损伤，改善肺功能，揭示NLRP3/caspase-1信号是治疗急性加重期COPD的靶点，另外VX-765联合清肺化痰颗粒，大鼠的病理损伤症状进一步减轻，Holfbauer评分、肺功能指标VT、Ri，BALF中IL-18及IL-1β水平，肺组织中NLRP3及caspase-1表达均更为降低，肺功能指标f、MV、PEF均进一步升高，表明清肺化痰颗粒和VX-765合用可协同下调NLRP3/caspase-1信号，减轻肺部炎性反应，修复肺损伤，改善肺功能作用更强，揭示NLRP3/caspase-1信号可能是清肺化痰颗粒治疗急性加重期COPD的分子机制。

综上所述，清肺化痰颗粒可减轻肺部炎性反应，修复肺损伤，改善肺功能，下调NLRP3/caspase-1信号可能是其药理机制，但本文未上调NLRP3/caspase-1信号进行进一步研究验证，存在一定的不足，还需后续的深入研究。