荧光染色与过碘酸希夫染色对真菌性角膜炎诊断效果的比较

杜满 张莉 李鹏 齐洪梅 鹿秀海

山东第一医科大学附属眼科医院 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 山东省眼科研究所 山东省眼科学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，济南 250021

真菌性角膜炎(fungal keratitis，FK)是一种严重的致盲眼病，常有植物外伤史。目前FK组织病理学检查主要采用的染色方法为苏木精-伊红染色和特殊染色。苏木精-伊红染色在大部分真菌不着色，诊断比较困难，主要用于观察角膜受感染的病理变化。因此特殊染色在真菌感染诊断中十分必要[1]。过碘酸希夫染色可使真菌细胞壁显示红色，利于观察，这种方法可显示大部分真菌。但是在日常工作中发现，某些FK的病原菌在过碘酸希夫染色中会着色不良或者不着色，且容易与变性的基质纤维混淆，另外，在检查角膜病灶切除标本或者菌丝含量较少的组织时易漏诊。随着荧光显微镜的普及，荧光染色也被应用到真菌的检测和诊断中，荧光染色液能与真菌细胞壁的纤维素、几丁质和其他含β-1，4-糖苷键的碳水化合物紧密结合，在紫外激发光(UA滤镜)下菌丝细胞壁及孢子细胞壁均呈亮蓝绿色，背景呈黑色，真菌的形态特征十分清晰，不易漏诊[2]。国外实验室早已将荧光显微镜用于FK等疾病病原真菌的检测[3]，但国内尚未将此检查作为常规的检查方法，而且一些特殊菌种所致的FK，过碘酸希夫染色效果较差，容易漏诊。本研究对临床上采集的FK标本分别进行荧光染色和过碘酸希夫染色，比较2种方法的诊断效率。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017年1月至2019年5月于山东第一医科大学附属眼科医院就诊且角膜刮片或真菌培养阳性的FK患者147例的角膜标本147份，其中行穿透角膜移植术(penetrating keratoplasty，PKP)患者84例，板层角膜移植术(lamellar keratoplasty，LKP)患者42例，病灶切除患者21例。147例患者中有146例行角膜刮片病原学检查均为阳性，1例未行角膜刮片检查，同时所有标本均行真菌培养和组织病理学检查。选取11例单纯疱疹病毒性角膜炎活检组织作为阴性对照。本研究经山东省眼科医院伦理委员会审核批准(批文号：SDSYKYY-2016012)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

角膜组织标本经常规固定、脱水、透明和浸蜡，4 μm厚切片，切片经二甲苯充分脱蜡至水。标本除行常规苏木精-伊红染色外，再分别进行真菌荧光染色和过碘酸希夫染色。

1.2.1真菌荧光染色 直接向标本上滴加1滴真菌荧光染色液(江苏诺鬲生物科技有限公司)，染色液以覆盖或淹没整个标本为准，使染料与标本充分结合，持续染色1 min；盖上盖玻片，吸去多余染液。荧光显微镜下真菌菌丝和孢子呈亮蓝绿色荧光。

1.2.2过碘酸希夫染色 向标本上滴加1滴过碘酸染色10 min，水洗，希夫染液(糖原染色试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司)避光浸染20 min，倾去染液，直接滴加偏重亚硫酸钠作用1 min，共2次，流水冲洗10 min，苏木素淡染，脱水、透明、封固。置于光学显微镜下观察，真菌菌丝和孢子呈紫红色染色为阳性染色。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。本研究中计数资料以例数和百分比表示。2种染色方法阳性率的比较，以及不同手术方式切除FK角膜组织2种染色方法的阳性率比较均采用配对卡方检验(McNemar's test)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 真菌荧光染色及过碘酸希夫染色镜下特点

真菌荧光染色组织标本菌丝结构清晰，可见横隔、分枝，角膜基质呈淡蓝色，背景呈黑色。过碘酸希夫染色角膜基质呈粉红色(图1)。

图1 真菌过碘酸希夫染色和荧光染色镜下特点 A：真菌菌丝和孢子呈紫红色，角膜基质呈粉红色(PAS ×400，标尺=100 μm) B：荧光染色可见真菌菌丝和孢子呈亮蓝绿色荧光，菌丝结构清晰，可见横隔、分枝，角膜基质呈淡蓝色，背景呈黑色(×400，标尺=100 μm)Figure 1 Fungal samples after periodic acid Schiff staining and fluorescence staining under fluorescence microscope A:PAS stained fungal hyphae and spores were purplish red,and corneal stroma was pink (PAS ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,fungal hyphae and spores were bright blue-green fluorescence,and mycelial structure was clear to see transverse septum and branches,and corneal stroma was light blue,and background was black (×400,bar=100 μm)

2.2 真菌荧光染色与过碘酸希夫染色的阳性率比较

过碘酸希夫染色的阳性率为60.5%(89/147)，真菌荧光染色的阳性率为79.6%(117/147)，荧光染色法诊断FK的阳性率高于过碘酸希夫染色法，差异有统计学意义(χ2=28.00，P<0.01)(表1)，2种染色方法的特异性均为100%。PKP手术切除标本荧光染色的阳性率为85.7%(72/84)，过碘酸希夫染色的阳性率为65.5%(55/84)，荧光染色的阳性率明显高于过碘酸希夫染色，差异有统计学意义(χ2=17.00，P<0.01)；LKP手术切除标本荧光染色的阳性率为71.4%(30/42)，过碘酸希夫染色的阳性率为52.4%(22/42)，荧光染色的阳性率明显高于过碘酸希夫染色，差异有统计学意义(χ2=8.00，P<0.01)；病灶切除标本荧光染色的阳性率为71.4%(15/21)，过碘酸希夫染色的阳性率为57.1%(12/21)，差异无统计学意义(χ2=1.30，P=0.25)(表2)。11例阴性对照行荧光染色和过碘酸希夫染色结果均为阴性。

表1 2种染色方法诊断FK的结果比较Table 1 Comparison of the diagnostic results of FK by two staining methods染色方法总例数阳性例数阴性例数过碘酸希夫染色1478958荧光染色14711730χ2值28.00P值<0.01 注:(配对卡方检验) FK:真菌性角膜炎 Note:(McNemar's test) FK:fungal keratitis

表2 不同手术方式切除FK角膜组织2种染色方法的阳性率比较Table 2 Comparison of the positive rates of two staining methods for resected corneal tissue with FK by different surgical methods染色方法PKPLKP病灶切除总例数阳性例数阴性例数总例数阳性例数阴性例数总例数阳性例数阴性例数过碘酸希夫染色84552942222021129荧光染色84721242301221156χ2值17.008.001.30P值<0.01<0.010.25 注:(配对卡方检验) FK:真菌性角膜炎;PKP:穿透角膜移植术;LKP:板层角膜移植术 Note:(McNemar's test) FK:fungal keratitis;PKP:pentrating keratoplasty;LKP:lamellar keratoplasty

2.3 不同真菌菌株标本间真菌荧光染色与过碘酸希夫染色的比较

真菌培养阳性标本共119例，阳性率为81.0%(119/147)。经鉴定共23种(属)真菌，较常见的真菌有黄曲霉复合群、茄病镰刀菌复合群、层生镰刀菌和链格孢霉，分别占31.9%(38/119)、17.6%(21/119)、10.1%(12/119)和9.2%(11/119)。不同菌种所致角膜真菌感染的标本荧光染色和过碘酸希夫染色的阳性例数不同，其中茄病镰刀菌复合群、谲诈腐霉菌、烟曲霉复合群、季也蒙假丝酵母、木霉和铺叶沼兰褐莺真菌荧光染色的阳性例数分别为19、5、5、1、1和1例，过碘酸希夫染色的阳性例数分别为11、0、3、0、0和0例。谲诈腐霉、季也蒙假丝酵母、木霉和铺叶沼兰褐莺真菌行过碘酸希夫染色均未见菌丝或孢子，其中谲诈腐霉感染的角膜可见较多平行于角膜基质的圆形或长条形空隙，组织中较少见浸润的炎症细胞，谲诈腐霉经荧光染色后，可见平行于角膜基质内生长的菌丝，菌丝较粗且分支少，菌丝的荧光较其他菌种弱。烟曲霉复合群、刺盘孢和构巢曲霉行过碘酸希夫染色后，菌丝染色较淡且结构欠清晰，较易漏诊，而经荧光染色后，菌丝荧光性强，形态特征明显、清晰，不易漏诊(表3,图2)。

表3 FK的真菌培养、过碘酸希夫染色及荧光染色结果比较Table 3 Comparision of fungal culture,periodic acid Schiff staining and fluorescence staining results in FK真菌感染类型总例数不同方法检测真菌感染的阳性标本例数过碘酸希夫染色荧光染色黄曲霉复合群382729茄病镰刀菌复合群211119层生镰刀菌1279链格孢霉1199谲诈腐霉菌505烟曲霉复合群535镰刀菌属434轮枝镰刀菌444刺盘孢323近平滑念珠菌222肉色镰刀菌222构巢曲霉111季也蒙假丝酵母101尖端赛多孢111离孺孢霉100木霉101铺叶沼兰褐莺真菌101双胞镰刀菌111藤仓镰刀菌复合群111新月弯孢霉100中介弯孢霉111帚枝霉111无孢霉100合计11976100 注:FK:真菌性角膜炎 Note:FK:fungal keratitis

图2 不同菌株的PAS和荧光染色结果 A：谲诈腐霉感染的角膜可见较多平行于角膜基质的圆形或长条形空隙，组织中较少见浸润的炎症细胞(PAS ×400，标尺=100 μm) B：谲诈腐霉经荧光染色后，可见平行于角膜基质内生长的菌丝，菌丝较粗分支少，菌丝的荧光较弱(×400，标尺=100 μm) C：烟曲霉复合群经PAS染色后，菌丝染色较淡，结构欠清晰(PAS ×400，标尺=100 μm) D：烟曲霉复合群经荧光染色后，菌丝荧光性强，形态特征明显、清晰(×400，标尺=100 μm) E：刺盘孢经PAS染色后，菌丝染色较淡，结构欠清晰(PAS ×400，标尺=100 μm) F：刺盘孢经荧光染色后，菌丝荧光性强，形态特征明显、清晰(×400，标尺=100 μm) G：构巢曲霉经PAS染色后，菌丝染色较淡，结构欠清晰(PAS ×400，标尺=100 μm) H：构巢曲霉经荧光染色后，菌丝荧光性强，形态特征明显、清晰(×400，标尺=100 μm)Figure 2 PAS staining and fluorescence staining results of different strains A:More round or long strip spaces parallel to the corneal stroma were observed in the cornea infected by Pythium insidiosum,and infiltrated inflammatory cells were fewer in the tissue (PAS ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,the hyphae of Pythium insidiosum growing parallel to the corneal stroma had few thick branches and weak fluorescence (×400,bar=100 μm) C:After PAS staining,the hyphae staining of Aspergillus fumigatus complex was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) D:After fluorescence staining,the hyphae fluorescence of Aspergillus fumigatus complex was strong,and the morphological characteristics were obvious and clear (×400,bar=100 μm) E:After PAS staining,the hyphae staining of Colletotrichum was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) F:After fluorescence staining,the hyphae of Colletotrichum had strong fluorescence,obvious and clear morphological characteristics (×400,bar=100 μm) G:After PAS staining,the hyphae staining of Aspergillus nidulans was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) H:After fluorescence staining,the hyphae of Aspergillus nidulans had strong fluorescence,obvious and clear morphological characteristics (×400,bar=100 μm)

2.4 真菌与其他物质的鉴别诊断

荧光染色液除与真菌细胞壁的成分结合生成复合物，在紫外激发光照射下产生荧光外，病变角膜组织中的炎症细胞、变性的胶原纤维、活化的角膜基质细胞以及切片上的杂质均可与荧光染液结合，产生强弱不等的荧光。角膜组织中浸润的炎症细胞需与念珠菌的孢子相鉴别，后者体积较大，一般在基质层间成簇分布，产生的荧光比炎症细胞强且孢子壁的荧光强于孢子中央，而炎症细胞的表现却相反，中间的细胞核呈现较明亮的荧光，细胞膜的荧光不明显，结合常规苏木精-伊红染色则较容易识别炎症细胞。感染性角膜组织基质纤维变性、水肿、排列紊乱，此时变性的胶原纤维也可与荧光染液结合发出荧光，镜下表现为异常弹性样组织的圈状或丝状荧光，但此结构为实心，未见分隔，与真菌呈中空的菌丝壁不同，而且比真菌菌丝细。角膜基质细胞的细胞核呈长椭圆形，细胞质少，常位于板层纤维间，与板层纤维平行排列，基质细胞的荧光强度比真菌弱，对照常规苏木精-伊红染色切片容易区别。荧光染色制片过程中，可能混入棉絮或其他纤维性杂质，此时杂质与荧光染液结合常发出强烈的荧光，亮度强于真菌菌丝，但根据荧光物质的形态及其与组织标本的关系一般可以做出判断(图3)。

图3 真菌与其他物质的鉴别诊断 A：角膜组织中浸润的炎症细胞(HE ×400，标尺=100 μm) B：荧光染色可见炎症细胞的细胞核呈现比较明亮的荧光，细胞膜的荧光不明显(×400，标尺=100 μm) C：念珠菌在角膜基质间成簇分布，体积比炎症细胞大(PAS ×400，标尺=100 μm) D：荧光染色可见念珠菌的荧光比炎症细胞强且孢子壁的荧光强于孢子中央(×400，标尺=100 μm) E：变性的角膜基质纤维，纤维排列紊乱(HE ×400，标尺=100 μm) F：荧光染色可见变性的胶原纤维与荧光染液结合，镜下表现为异常弹性样组织的圈状或丝状荧光(×400，标尺=100 μm) G：角膜基质细胞的细胞核呈长椭圆形，细胞质少(HE ×400，标尺=100 μm) H：荧光染色可见基质细胞荧光较真菌弱(×400，标尺=100 μm) I：荧光染色可见制片过程中混入的纤维性杂质，杂质与荧光染液结合发出强烈的荧光，亮度强于真菌菌丝(×200，标尺=200 μm)Figure 3 Antidiastole of fungi and other substances A:Infiltrated inflammatory cells in corneal tissue (HE ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,the nucleus of inflammatory cells showed bright fluorescence,but the fluorescence of cell membrane was not obvious (×400,bar=100 μm) C:Candida showed cluster distribution among the corneal stroma,and the volume of Candida was larger than the inflammatory cells (PAS ×400,bar=100 μm) D:After fluorescence staining,the fluorescence of Candida was stronger than the inflammatory cells,and the fluorescence of the spore wall of Candida was stronger than that of spore centre (×400,bar=100 μm) E:Denatured corneal stroma fibers with a disordered fiber arrangement (HE ×400,bar=100 μm) F:After fluorescence staining,the denatured collagen fiber bounded to the fluorescence dye and appeared as abnormal elastic tissue with a circular or filamentous fluorescence under microscope (×400,bar=100 μm) G:The nucleus of corneal stroma cells was long oval and the cytoplasm was little (HE ×400,bar=100 μm) H:After fluorescence staining,the fluorescence of stroma cells was weaker than fungi (×400,bar=100 μm) I:After fluorescence staining,the fibrous impurities that mixed in the preparation process showed strong fluorescence after combination with the fluorescence dye,and the fluorescence was stronger than the fungal hyphae (×200,bar=200 μm)

3 讨论

随着FK临床诊疗经验的积累和实验室检查技术的提高，相关研究发现有70多种真菌可引起角膜感染[4]，在不同国家及地区引起FK的菌种差别较大，气候寒冷地区及发达国家以白念珠菌为主，气候温暖或炎热地区及发展中国家以镰刀菌和曲霉菌为主[5]。本研究中共有147例FK患者行真菌培养，培养阳性119例，阳性率为81.0%，较常见的致病菌为黄曲霉复合群、茄病镰刀菌复合群、层生镰刀菌及链格孢霉，与以往报道基本一致[6]。

如何快速、准确地诊断FK对指导临床治疗具有重要意义。角膜刮片氢氧化钾(KOH)湿片检查和真菌培养是较常用的实验室检查方法，KOH湿片检查方法简单，通过刮取病变处角膜组织后滴加质量分数10%的KOH溶解杂质，于光学显微镜下观察，结果显示阳性率为60.0%～81.0%[7-11]，但受限于角膜取材质量及检查人员的诊断水平，存在一定的假阴性结果，而且对于角膜移植术后复发的真菌性角膜感染，由于病灶位于角膜深层，表层刮片一般找不到真菌。真菌培养是诊断角膜真菌感染较可靠的方法，不仅可以明确真菌感染，还可以对菌种进行鉴定和药敏分析，但真菌培养的阳性率偏低，约为50%[12-14]，而且培养时间长。激光扫描共焦显微镜是一种无创性、高分辨率的活体检查方法，其分辨率理论上可达1 μm，可以在细胞水平上对角膜进行观察，在诊断角膜疾病中得到广泛应用[15-16]，但是病变进展以及抗真菌药物的应用可使菌丝变得不典型，从而影响诊断的准确性。

病理检查是疾病诊断的重要方法，组织病理学常规染色方法对真菌着色能力差，常难以分辨，在日常工作中常利用特殊染色来帮助识别真菌。过碘酸希夫染色是常用的特殊染色方法，其原理是过碘酸氧化真菌细胞壁上的多糖，使醛基游离，无色品红可与游离的醛基结合生成复合物而被显色。真菌荧光染色液利用特异性的荧光标志物共价结合在β-糖苷基团，形成β多糖-荧光素复合物并发出特异荧光[17]。真菌细胞壁所含的多糖类物质，如几丁质和葡聚糖，是一类典型的β-型多糖，荧光素与真菌细胞壁的多糖特异性结合，形成强的荧光复合物，在荧光显微镜下观察，可以清晰地显示真菌的形态。本研究中所使用的真菌荧光染色液操作简单、省时，石蜡组织标本充分脱蜡后滴加1滴荧光染液，1 min后便可在荧光显微镜下观察到染色结果。本研究中收集的147例真菌感染角膜组织分别行过碘酸希夫染色和荧光染色，结果显示荧光染色法诊断FK的阳性率高于过碘酸希夫染色法，与阎艳等[18]的研究结果一致。真菌荧光染色法可以快速、准确地诊断FK，对指导临床治疗具有重要意义。

真菌感染所致的角膜溃疡由于菌丝侵犯角膜深度不同会采取不同的手术方式，本研究中根据不同手术方式分为PKP标本、LKP标本和病灶切除标本。本研究结果显示，不同手术方式切除的标本应用荧光染色更容易识别组织中的少量菌丝，染色后与背景对比鲜明，容易辨别，弥补了过碘酸希夫染色法在菌丝含量较少时敏感性低的不足。

过碘酸希夫染色法可以显示大部分的真菌[19]，但是我们在日常工作中发现部分真菌会出现染色不良或者不着色的情况。本研究中真菌培养结果阳性者为119例，通过研究不同菌种过碘酸希夫染色和荧光染色的结果发现，茄病镰刀菌复合群、谲诈腐霉、烟曲霉复合群、季也蒙假丝酵母、木霉和铺叶沼兰褐莺真菌行荧光染色的阳性例数明显高于过碘酸希夫染色，其中谲诈腐霉、季也蒙假丝酵母、木霉和铺叶沼兰褐莺真菌过碘酸希夫染色均未检出菌丝或孢子。本研究中谲诈腐霉所致的FK共5例，过碘酸希夫染色均未着色，可见较多平行于角膜基质的圆形或长条形空隙，组织中较少见浸润的炎症细胞，荧光染色可显示真菌的形态，但是菌丝的荧光较其他菌种弱，这可能与细胞壁中缺乏几丁质有关[20]。烟曲霉复合群、刺盘孢和构巢曲霉行过碘酸希夫染色后虽然可以观察到菌丝，但是菌丝染色较淡且结构欠清晰，较易漏诊，经荧光染色后，菌丝荧光性强，形态特征明显、清晰，不易漏诊。由此可见，真菌荧光染色可弥补过碘酸希夫染色的不足，提高真菌的检出率。但荧光染色液不仅可以与真菌细胞壁结合发出荧光，还可以与组织中的其他成分结合产生强弱不等的荧光，所以在诊断FK时需要仔细辨别，可以结合过碘酸希夫染色或苏木精-伊红染色结果综合判断分析。

综上所述，本研究结果显示荧光染色诊断FK的敏感性高，特异性强，判断直观且操作简便，对目前绝大多数FK致病菌种有良好的染色效果，荧光显微镜的普及可以使该方法得到进一步的推广。由于不同真菌菌株的标本量有限，无法对不同真菌菌株标本间2种染色的阳性率进行统计分析，后期还需增大样本量进一步验证。荧光染色法对其他病原体感染导致的角膜炎是否有诊断价值仍需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突