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荞麦壳中总黄酮含量测定方法优选*

2021-02-26苏学军宗春燕

化学工程师 2021年12期
关键词:比色法中总芦丁

苏学军,裘 可,宗春燕

(泰州职业技术学院,江苏 泰州 225300)

荞麦是一种一年生双子叶植物,可药食两用。作为消费者喜爱的一种小宗杂粮,荞麦具有独特的营养优势,不仅营养素全面、矿物元素含量丰富,还含有其它禾谷类粮食较为缺乏的赖氨酸和黄酮类物质[1],常被人们视为“养颜益寿食物、天然保健珍品”。荞麦壳是制作荞麦仁时产生的副产品,目前,荞麦壳除部分用于制作枕芯或饲料外,其余大多作为废弃物而被抛弃[2]。近年来的研究表明,荞麦壳中含有多种活性组分,尤其以黄酮类活性物质居多[2]。荞麦黄酮抗氧化能力强[3],长期食用可以降血糖、降血脂,调节肠道菌群平衡,甚至有一定防癌抗癌功效[4-6]。从荞麦壳中提取出的黄酮类物质,特别是芦丁,临床上可用于消炎、利尿、解痉、治疗血管病、肥胖症等症状[7],而使其深受人们的关注。

目前,对于荞麦壳中黄酮含量的测定方法主要采用高效液相色谱法(HPLC)和分光光度法(UV)[8]。HPLC 法虽能同时测定样品中的多种黄酮类组分,但获得的是各黄酮单体的含量,在无法得知样品中所有黄酮类组分的情况下,难以完成总黄酮含量的测定。由于荞麦壳中的黄酮类物质种类较多[9],因而测定总黄酮含量时选择分光光度法为宜。本文以芦丁为对照品,考察了直接测定法、AlCl3-NaAc 比色法及NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法对荞麦壳总黄酮含量测定的可行性,筛选出一种适宜的测定方法,以期为荞麦壳中总黄酮的提取开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

荞麦壳(新街粮油加工厂提供(系泰兴甜荞));芦丁标准品(上海伊卡生物技术有限公司);无水乙醇、NaNO2、AlCl3、Al(NO3)3、NaOH、NaAc,均为国产分析纯;实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

UV-1801 型紫外-可见分光光度计(北京北分瑞利仪器有限责任公司);KQ5200E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);BJ-150 型多功能粉碎机(德清拜杰电器有限公司);80-2 型台式离心机(上海浦东物理光学仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 荞麦壳中总黄酮的提取 取适量荞麦壳置减压烘箱中低温烘干水分,直至恒重,取出后立刻粉碎过筛。准确称取3g 荞麦壳粉末,放入250mL 三口烧瓶中,并加入质量分数为70%的乙醇溶液,设定料液比为1∶20(g·mL-1),室温下浸泡1h,然后置于70℃的水浴中回流提取1h。提取液经离心分离后,收集至棕色容量瓶中,冷藏备用。

1.3.2 对照品溶液的配制 精密称取芦丁标准品19.8mg,加入质量分数为70%的乙醇溶液,室温下置超声波清洗器中超声一段时间,待全部溶解后,转入100mL 的棕色容量瓶中,再以上述乙醇定容至刻度,摇匀,配成浓度为198μg·mL-1的芦丁对照品溶液,避光保存备用。

1.3.3 荞麦壳中的总黄酮含量测定方法

直接测定法 取2 只25mL 的洁净的容量瓶,分别移入1mL 荞麦壳提取液、1mL 芦丁对照品溶液,再分别以质量分数为30%的乙醇溶液定容,摇匀后,静置15min,以试剂为空白,在200~600nm 区间进行光谱扫描。

AlCl3-NaAc 比色法 取2 只25mL 的洁净的容量瓶,分别移入1mL 荞麦壳提取液、1mL 芦丁对照品溶液,再分别加入1.5%的AlCl3溶液4mL,1mol·L-1NaAc 溶液8mL,以质量分数为30%的乙醇溶液定容,摇匀后置于30℃水浴中显色反应15min,以试剂为空白,在300~600nm 区间进行光谱扫描。

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法 取2 只25mL的洁净的容量瓶,分别移入1mL 荞麦壳提取液、1mL芦丁对照品溶液,然后再分别依次移入5%的NaNO2试剂1mL,摇匀静置6min,移入10%的Al(NO3)3试剂1mL,再摇匀静置6min,最后加入10mL 4%的NaOH 溶液,以质量分数为30%的乙醇溶液定容,摇匀后,静置15min,以试剂为空白,在400~600nm 区间进行光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 荞麦壳中总黄酮测定方法优选

芦丁及荞麦壳样品的吸收光谱曲线见图1。

图1 直接测定法吸收光谱曲线Fig.1 Absorption spectrum curve of direct determination method

由图1 可知,两种物质在紫外区的吸收带各不相同,芦丁在紫外区存在两个吸收峰,分别位于257.5 和362nm 处,而荞麦壳样品仅有一个吸收峰在275nm 处。由于紫外区的测定易受溶剂及杂质的干扰[10],且样品与芦丁的吸收峰相距较远,故不宜选用直接测定法测定。

图2 为AlCl3-NaAc 比色法的吸收光谱曲线。

图2 AlCl3-NaAc 比色法吸收光谱曲线Fig.2 Absorption spectrum curve of AlCl3-NaAc colorimetric method

在芦丁对照品溶液中加入AlCl3显色剂后,芦丁的最大吸收峰红移至416nm 处,而荞麦壳提取液的最大吸收波长在可见光区为404nm。故该法以芦丁为对照品时,可选择416nm 作为测定波长。由于提取液在416nm 处存在本底吸收,因此,后续测定样品中总黄酮含量时,以试液空白为参比,测定吸光度值。

图3 是NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法的吸收光谱曲线。

图3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法吸收光谱曲线Fig.3 Absorption spectrum curve of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method

该法待显色反应发生后,溶液中会出现较多絮状物,离心过滤后测定吸收曲线。荞麦壳提取液的最大吸收波长位于491nm 处,而芦丁在505nm 处有一明显的吸收峰,因此,可选择505nm 作为测定波长。

2.2 标准曲线

移取浓度为198μg·mL-1的芦丁对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL,按1.3.3 中AlCl3-NaAc 比色法与NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法进行显色反应,在各法最大吸收波长下测定相应吸光度。以吸光度A 为纵坐标,浓度C(μg·mL-1)为横坐标,得到前者线性方程为A=0.0270C+0.0570,R=0.9999;后者线性方程为A=0.0104C-0.0031,R=0.9998。

2.3 荞麦壳中总黄酮含量测定比较

采用AlCl3-NaAc 比色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法测定荞麦壳中的总黄酮含量,实验结果见表1。

表1 2 种比色法测定荞麦壳中的总黄酮(mg·g-1)Tab.1 Determination of total flavonoids in buckwheat hull by two colorimetric methods

由表1 可以看出,后法的测定值明显高于前法。这是由于荞麦壳提取液中的儿茶素、咖啡酸等酚酸类物质在碱性条件下可与Al(NO3)3发生显色反应,造成测定值偏大。因此,测定荞麦壳中的总黄酮,采用AlCl3比色法专属性强,准确度高。

2.4 方法学考察

2.4.1 稳定性 精密移取1mL 荞麦壳提取液,按1.3.3 中AlCl3-NaAc 比色法进行显色反应后,在静置10、20、30、40、50、60min 时,于416nm 处测定吸光度值,分别为0.3354、0.3401、0.3397、0.3444、0.3500、0.3456,平均吸光度为0.3425,RSD 为1.20%。表明荞麦壳提取液采用AlCl3-NaAc 比色法显色后,吸光度在10~60min 内有较好的稳定性。

2.4.2 精密度 精密移取1mL 荞麦壳提取液,采用AlCl3-NaAc 比色法进行显色反应,于416nm 处连续测定6 次吸光度值,分别为:0.3389、0.3391、0.3404、0.3395、0.3400、0.3398,计算RSD 为0.12%,说明方法的精密度良好。

2.4.3 重现性 按1.3.1 制备荞麦壳提取液,平行移取6 份样品,均为1mL,采用AlCl3-NaAc 比色法进行显色反应,每份样品测定3 次,计算荞麦壳总黄酮含量分 别 为5.324、5.246、5.339、5.424、5.377、5.274mg·g-1,RSD 为0.92%,表明方法的重现性较好。

2.4.4 加标回收率 精密移取1mL 荞麦壳提取液5份,再分别加入芦丁标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,采用AlCl3-NaAc 比色法进行显色反应后,测定吸光度并考察方法的回收率,结果见表2。

表2 加标回收率试验Tab.2 Standard addition recovery test

由表2 可知,该法的加标回收率在97.47%~103.53%之间,RSD 为1.92%,显示结果较为可靠。

3 结论

本实验利用紫外可见分光光度法测定荞麦壳中的总黄酮,通过比较3 种比色法的光谱吸收曲线,并通过方法学验证,确定以芦丁为对照品,采用AlCl3-NaAc 比色法于最大吸收波长416nm 处测定黄酮含量。结果显示,该方法操作简便,稳定性好,专一性强,加标回收率为97.47%~103.53%,可作为荞麦壳中总黄酮的定量分析方法。

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