低温胁迫下红松与西伯利亚红松光合与气孔特性

王 芳 陆志民 王 君 张世凯 李峪曦 李绍臣 张建秋 杨雨春*

（1. 吉林省林业科学研究院，长春 130000；2. 东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）

温度是影响林木生长发育的重要因素，对林木生长发育起至关重要的作用。林木只有在最适温度条件下才能表现出最大产量，如果生存温度过高或者过低，林木生长的新陈代谢及生理过程均会发生变化［1］。目前，国内外关于低温胁迫的研究越来越详细，逐渐由低温胁迫下表型、生理生化向分子研究转变。在诸多体现低温胁迫的生理指标中，光合作用是最先，也是最容易测定的指标之一，也是判断植物抗逆性强弱的重要因素［2］。在低温胁迫下，低温可以降低植物光合过程中相关酶活性，导致光合速率下降［3］，但由于应对不同胁迫温度与胁迫时间［4］，植物生长与生理指标可表现较大差异。

红松（Pinus koraiensis）与西伯利亚红松（Pinus sibirica）是中国东北以及俄罗斯等寒温带地区生长的重要顶级群落树种，对其研究较多，重点在良种选育［5］、木材特性［6］、育苗技术［7］、生态效益［8］、分子结构［9］等，而对于红松与西伯利亚红松光合特性研究较少［10］。20 世纪80 年代，红松曾大量引种至大兴安岭北坡寒冷地区，但由于抗寒性较差，全部死亡［11］，之后在东北林业大学科研团队的带领下，大兴安岭林区大量引种西伯利亚红松，至今已经开花、结实、育苗，表明大兴安岭北坡等寒冷地区引种西伯利亚红松是可行的，也表明西伯利亚红松与红松的抗低温能力具有较大差异，西伯利亚红松较红松具有更强的耐寒性。为探讨低温胁迫下红松与西伯利亚红松的生理响应机制及抗寒生理机理，本实验室对红松和西伯利亚红松幼苗的质膜透性、超氧化物歧化酶、可溶性糖等10个生理指标进行测定，发现红松与西伯利亚红松幼苗在高于-40℃的低温胁迫下植株均可正常生长，各指标均体现一定的变化趋势，而-60℃和-80℃时2 个树种幼苗均已冰冻致死［12］。基于以上研究背景，本研究以西伯利亚红松和红松为实验材料，对低温胁迫下（高于-40℃的低温）幼苗的光合特性、气孔特性进行测定分析，进一步探究低温胁迫下两树种间的光合指标、气孔特性及形态等变化情况，为红松以及西伯利亚红松抗寒研究提供理论依据。

1 实验材料与实验方法

1.1 实验材料

红松与西伯利亚红松的种子分别来自中国吉林省龙井市（129°45′E，42°40′N）和俄罗斯新西伯利亚（82°55′E，55°2′N），新西伯利亚的年均温、1月气温和7 月气温分别是0.2℃、-18.8℃和19.0℃［5］，龙井的年均温、1 月气温和7 月气温分别是5.3℃、-13.4℃和21.2℃［13］。西伯利亚和龙井的最低温分别是-60℃和-34.8℃［14］。2010 年采种，次年播种，4年后选择生长健壮的红松和西伯利亚红松幼苗放在东北林业大学白桦强化种子园中进行培育。

1.2 实验方法

本实验设计3 个胁迫温度（0℃、-20℃和-40℃）和3个胁迫时间（6、24和48 h），以20℃（室温）为对照，共计10 个处理。各树种在不同处理条件下分别以24株为实验材料。低温处理利用低温光照培养箱（丙林SPX-800FT（-22℃～60℃））和海尔DW-40W380（-20℃～-40℃）进行，将栽植于容器内的幼苗直接放入相应的低温仪器中处理，低温处理后，恢复30 min 进行光合指标与气孔性状的测定。采用美国lico 公司生产的lico-6400 光合仪对不同单株第二轮枝条上的针叶进行各光合指标测定，测量时，光照强度和CO2分别设定为1 600µmol·m-2·s-1和400 µmol·mol-1，其他环境因子不进行控制，仪器输出数据主要包括瞬时光合速率（Pn，µmol·m-2·s-1）、蒸腾速率（Tr，µmol·m-2·s-1）和气孔导度（Gs，mol·m-2·s-1）等。气孔的观察采用扫描电镜法，用NeoScope 型台式扫描电镜观察不同处理的针叶并拍照。利用CellSens Entry 显微图像软件测得气孔密度、保卫细胞长宽度和气孔开度等信息。

气孔面积［15］=3.14×（保卫细胞长度/2×气孔开度/2）

在对光合实验结果进行处理的过程中发现，-20℃时两树种的净光合速率已出现负值，因此未对-40℃处理的苗木进行光合指标的测定。

2 结果与分析

2.1 不同处理下光合特性的t检验

t 检验结果见表1。在室温（20℃）和任一低温处理条件下，各光合指标在红松与西伯利亚红松中的差异是显著的（P＜0.05），表明红松与西伯利亚红松在正常状态下和在应对低温胁迫时的光合能力均具有显著差异。

表1 不同处理条件下各光合指标的t检验Table 1 t test of each photosynthetic index under different treatments

2.2 红松与西伯利亚红松光合特性的方差分析比较

本研究以不同处理为变异来源，进行单因素方差分析（见表2）。红松与西伯利亚红松在不同处理条件下各测定指标差异均达极显著水平（P＜0.01），表明低温以及低温胁迫时间对红松与西伯利亚红松各光合指标影响较大。

2.3 低温胁迫下红松与西伯利亚红松的净光合速率

不同处理条件下红松与西伯利亚红松净光合速率见图1，在室温（20℃）条件下，红松与西伯利亚红松净光合速率Pn分别为14.65和11.95µmol·m-2·s-1，随着温度降低与胁迫时间的延长，这两个树种净光合速率均呈显著下降趋势，在0℃处理条件下，2个树种稳步下降，但是在-20℃处理条件下，红松净光合速率急剧下降，胁迫6 h 后平均净光合速率只有0.66 µmol·m-2·s-1，在胁迫24 与48 h 均达负值。西伯利亚红松在-20℃处理后6 h 平均净光合速率显著高于红松，达到3.81µmol·m-2·s-1，在胁迫24 h后平均净光合速率也在0 以上（0.34µmol·m-2·s-1），在胁迫48 h后达到负值。

2.4 低温胁迫下红松与西伯利亚红松的气孔导度

不同处理条件下，红松与西伯利亚红松气孔导度Gs见图2。在室温（20℃）条件下，红松与西伯利亚红松Gs分别为0.682 和0.589 mol·m-2·s-1，随着温度降低与胁迫时间的延长，这两个树种Gs均呈显著下降趋势。在0℃处理条件下，2 个树种的Gs均随着低温胁迫时间的延长稳步下降，变化范围分 别 为0.506～0.291 mol·m-2·s-1和0.386～0.208 mol·m-2·s-1，但是在-20℃处理条件下，红松Gs急剧下降，胁迫6 h 后平均Gs只有0.036 mol·m-2·s-1，在胁迫24 与48 h 分别为0.029 和0.028 mol·m-2·s-1。西伯利亚红松在-20℃处理后6 h 平均Gs比红松高3.75倍，达到0.135 mol·m-2·s-1，在胁迫24与48 h的Gs分别为0.022和0.018 mol·m-2·s-1。

表2 不同处理条件下红松与西伯利亚红松各光合指标的方差分析Table 2 Variance analysis of photosynthetic indices of P.koraiensis and P.sibirica under different treatments

2.5 低温胁迫下红松与西伯利亚红松的蒸腾速率

不同处理条件下红松与西伯利亚红松蒸腾速率Tr见图3。在室温（20℃）条件下，红松与西伯利亚红松蒸腾速率Tr分别为2.485和2.096µmol·m-2·s-1，随着温度降低与胁迫时间的延长，这两个树种Tr均呈显著下降趋势。在0℃处理条件下，2 个树种稳步下降，变化范围分别为1.840～1.154 和1.408～0.816µmol·m-2·s-1。在-20℃处理条件下，红松Tr急剧下降，胁迫6 h 后平均Tr只有0.144µmol·m-2·s-1，在胁迫24与48 h分别为0.117和0.114µmol·m-2·s-1。西伯利亚红松在-20℃处理后6 h平均Tr是红松的3.67倍，达到0.529 µmol·m-2·s-1，在胁迫24 与48 h 的Tr分别为0.089和0.072µmol·m-2·s-1。

2.6 气孔特性的t检验

5 个气孔特性相关指标的t 检验结果见表3。红松的气孔密度与西伯利亚红松的气孔密度差异显著（P＜0.05），保卫细胞长、保卫细胞宽、气孔开度和气孔面积在红松与西伯利亚中差异不显著。

2.7 红松与西伯利亚红松气孔特性比较的方差分析

各气孔特性相关指标的双因素方差分析见表4。不同温度条件下，红松与西伯利亚红松气孔开度与气孔面积差异均达极显著水平（P＜0.01），其余各指标差异均未达显著水平。不同时间或不同的温度×时间的互作对各指标没有显著影响，差异不显著。因此以下仅研究了不同温度下红松与西伯利亚红松形态和特征。

表3 各气孔特性指标的t检验Table 3 t test of each stomatal character index

表4 红松和西伯利亚红松气孔各测定指标的双因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA of each index for P.koraiensis and P.sibirica

2.8 不同低温胁迫下红松与西伯利亚红松的气孔形态及特征

胁迫前红松与西伯利亚红松的气孔均为椭圆形（见图4：A，E），随着温度的降低，红松与西伯利亚红松针叶气孔呈现相同变化趋势，从对照20℃到0℃、-20℃，气孔开度均显著下降，-40℃与-20℃气孔开度差异不显著。低温胁迫下红松与西伯利亚红松具体气孔特性见表5。处理前后气孔密度变化不大，没有显著差异，红松与西伯利亚红松变化范围分别为2.0×10-4～2.4×10-4（个·µm-2）和2.0×10-4～2.1×10-4（个·µm-2），红松的气孔密度显著大于西伯利亚红松（见表3）；从保卫细胞来看，随着温度的降低，保卫细胞长度和宽度则没有显著差异，红松与西伯利亚红松保卫细胞长度变化范围分别为42.63～45.95µm 和43.06～45.10µm，保卫细胞宽度变化范围分别为30.58～32.92 µm 和25.12～28.16 µm；低温对红松和西伯利亚红松气孔开度以及气孔面积影响较大，随着低温胁迫的加强，红松气孔开度变化范围为6.07～12.54µm，20℃处理条件下红松气孔开度是-40℃处理条件下的2.07倍；西伯利亚红松气孔开度的变化范围为5.83～13.44µm，20℃处理条件下西伯利亚红松气孔开度是-40℃处理条件下的2.31倍；低温胁迫下红松与西伯利亚红松气孔面积急剧下降，红松与西伯利亚红松气孔面积变化范围分别为212.15～421.38µm2和196.56～452.92µm2，最大值分别为最小值的1.99和2.30倍。

表5 不同温度胁迫下红松与西伯利亚红松的气孔特征Table 5 Stomatal characteristics of P.koraiensis and P.sibirica under different temperature stress

3 讨论

光合作用是植物生长和发育最重要的生理指标之一，高光合速率一般会增加植物同化二氧化碳和水的能力，最终产生高生物量［16］。本研究中胁迫前红松中的各光合指标均显著高于西伯利亚红松，红松与西伯利亚红松净光合速率分别为14.65 和11.95 µmol·m-2·s-1，与王曼［10］对二者之间的光合速率测定结果不同，原因可能是由于材料与测定环境不同造成的，王曼利用的是樟子松为砧木的嫁接苗，同时测定环境为室外，而本研究采用的是实生苗，在室内进行的光合测定实验，测定仪器所要求的环境因子控制的更理想。0℃的低温处理后，红松与西伯利亚红松中的各光合指标稳步下降，但红松中各光合指标值仍显著高于西伯利亚红松，说明0℃对两个树种是一个相对较弱的低温［12］。

随着低温胁迫的加重，红松与西伯利亚红松各光合指标值显著降低，-20℃时急剧下降，表明低温对二个树种均产生较强影响，这与刘伟对黄瓜（Cucumis sativus L.）［17］、须海荣对茶树（Camellia si⁃nensis L.）［3］、陈剑成对凹叶厚朴（Magnolia officina⁃lis subsp.biloba）［18］的研究结果相同。由于光合作用不仅与植物自身叶绿体结构有关，还与光合磷酸化、光合电子传递、暗反应相关的酶活性有关，低温不仅影响这些酶的活性，还可能造成光合机构的损伤［19］，本研究也再一次证明低温胁迫下红松与西伯利亚红松各生理指标逐渐降低的合理性［12］。低温胁迫下红松与西伯利亚红松气孔导度和蒸腾速率与光合速率变化规律相近，都是逐渐降低，且红松中各光合指标的含量高于西伯利亚红松，但在-20℃处理6 h 时，西伯利亚红松的净光合速率、蒸腾速率与气孔导度显著高于红松，表明在瞬间低温处理条件下，西伯利亚红松抵御低温的能力比红松强，这可能是西伯利亚红松抗寒性比红松强的间接因素之一，具体原因需要进一步研究。

气孔是由保卫细胞构成的，是直接影响植物叶片光合作用的细胞器，其会随着温度的高低呈现开放与闭合的状态［20］。温度变化可以影响气孔运动，当温度过高或者过低时，气孔会趋向关闭并引起气孔导度的变化，进一步影响植物的蒸腾速率和净光合速率［21］。本研究中红松中的气孔密度显著高于西伯利亚红松，而气孔长、气孔宽、气孔开度和气孔面积无显著差异，这可能是导致室温（20℃）和较弱的低温（0℃）下红松中的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率显著高于西伯利亚红松的原因之一。红松与西伯利亚红松在低温胁迫后，气孔开放程度明显下降，表明低温胁迫后，红松与西伯利亚红松会依靠大量生理代谢反应来降低胁迫带来的危害［22］，这也是这两个树种自我保护的体现。本研究中红松与西伯利亚红松光合速率下降、气孔导度降低除了与低温胁迫下各种酶活性能力下降有关以外［12］，气孔开放程度的降低也是重要因素之一。

总之，从低温胁迫下光合指标与气孔性状来看，红松与西伯利亚红松均形成系统的自我保护机制，但西伯利亚红松抗寒能力比红松稍强，这与二者其余生理指标研究结果相同［12］，下一步研究应以低温胁迫下两树种的分子机理研究为主，融合转录组、代谢组以及蛋白质组的测定与分析，切实为红松与西伯利亚红松的良种选育提供技术支撑。