基于网络药理学探讨四逆散治疗慢性乙型肝炎的作用机制*

李 硕 李小科 甘大楠 张嘉鑫 梁亦骏 叶永安△

1.北京中医药大学东直门医院脾胃病科 (北京， 100700) 2.北京中医药大学肝病研究所

慢性乙型肝炎(CHB)是乙型肝炎病毒(HBV)持续感染导致的慢性肝脏疾病。全球约有2.57亿慢性HBV感染者，每年约88.7万人因此死亡[1]。CHB在中医学中未明确病名，但该病具有传染性、迁延难愈等特征，可归为“伏邪温病”范畴，随病情进展亦可见于“黄疸”“臌胀”“积聚”等。若HBV慢性感染后未经治疗，40%的患者将进展为肝硬化，有发生失代偿期肝硬化及肝细胞癌的风险[1]，因此控制HBV感染，积极治疗CHB尤为重要。西药在抗病毒、阻断肝纤维化进程方面疗效确切，但仍存在耐药变异、停药后复发、药物副作用大等问题。四逆散出自张仲景《伤寒论》，由柴胡、白芍、枳实、甘草四味药物组成，其用药精简, 配伍严谨。已有多位学者通过动物实验及临床研究证明四逆散对治疗CHB具有一定作用[2-5]，指南推荐或临床上常用于治疗CHB的逍遥散[6]、柴胡疏肝散[7]亦由四逆散化裁而来。文献分析提示抑制HBV的核心药物群为黄芪、白术、茯苓、甘草、柴胡、白芍、丹参、郁金、茵陈、白花蛇舌草、虎杖[8]，四逆散中三味药物均位列其中。本课题组前期通过分析1 003例CHB(ALT≥2×ULN)患者中医常见症状及证候分布特点发现，肝郁脾虚证在CHB患者中具有较高的发生率，为其核心病机之一[9]。四逆散为调和肝脾之要方，从病机角度为四逆散治疗CHB提供了一定的支持依据。但四逆散治疗CHB的具体机制仍未进一步阐明，因此，本研究运用网络药理学方法挖掘四逆散治疗CHB的有效成分、作用靶点和信号通路，探讨其功效作用网络及药效作用机制。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件 中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php，Version:2.3 )；Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch)；Uniport数据库(https://www.uniprot.org)；GeneCards(https://www.genecards.org)；人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https://omim.org)；PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；String数据库(https://string-db.org)；Cytoscape软件(version 3.7.1)；R软件(x64 version 3.6.1)；R安装包：clusterProfiler[10]。

1.2 四逆散有效化合物及对应靶点筛选 在TCMSP平台中检索四逆散所含中药(包含柴胡、白芍、枳实和甘草)，收集四逆散的有效化合物成分，设定口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18为筛选条件，对所收集到的化合物进行筛选，并结合文献研究及《中国药典》2015年版中药物的含量测定项对已筛选的化合物进行补充。

从TCMSP中检索四逆散有效化合物对应的靶蛋白。若化合物相关靶点未被收录在TCMSP中，则在PubChem中检索该化合物的Smiles结构，导入Swiss Target Prediction数据库中进行靶点预测；若化合物未被PubChem收录或Swiss Target Prediction无法预测其相关靶点，则予以剔除。利用Uniport数据库中的Uni Pro KBt检索功能校正基因名称，删除非人源性靶点，获得活性成分与潜在作用靶点相关信息。

1.3 慢性乙型肝炎靶点预测 使用GeneCards、OMIM数据库以“chronic hepatitis B”为检索关键词，获取CHB相关的靶点，合并靶点基因并去除重复基因。

1.4 药物有效成分-靶点网络构建 将四逆散潜在活性靶点与CHB治疗靶点匹配，得到交集靶点，运用Cytoscape软件构建药物有效成分-靶点网络。节点连接度degree值表示与某点连接的边的数量，其值越大，该点在拓扑结构中的重要性越高。运用Cytoscape软件计算节点连接度degree，明确四逆散在治疗CHB中较重要的有效成分及靶点。

1.5 构建PPI网络及模块化分析 将四逆散治疗CHB的靶点导入String数据库，物种设置为“homo sapiens”，阈值设置为高等置信度，隐藏游离靶点，获取蛋白互作PPI网络，结果保存成TSV格式并导入Cytoscape软件绘制PPI网络，并利用Cytoscape软件中MCODE插件进行模块化分析，设置degree cutoff>2；K-Core设置为2，对其特征进行分析，筛选核心靶点模块。

1.6 GO和KEGG富集分析 利用R及clusterProfiler对四逆散治疗CHB的靶点进行GO和KEGG富集分析，设定阈值P<0.05，显示富集的前20位结果，以通过基因和通路的富集分析预测四逆散治疗CHB的机制。

2 结果

2.1 四逆散有效化合物筛选 依据筛选条件(OB≥30%，DL≥0.18)，在TCMSP数据库中收集有效成分：柴胡17个，白芍13个，枳实22个，甘草92个，根据中国药典及文献纳入柴胡皂苷a、柴胡皂苷d。甘草酸是甘草的主要活性成分，被广泛应用与多种肝病的治疗，甘草次酸亦具有保肝作用，故将二者纳入有效成分。剔除3个未被PubChem收录、2个Swiss Target Prediction无法预测相关靶点的化合物。最终确定化合物139个。由于结果较多，依据degree值大小，仅列出前10位较重要的有效化合物，见表1。

表1 四逆散前10位重要的有效成分

2.2 潜在作用靶点收集 在TCMSP或Swiss Target Prediction数据库中收集有效成分靶点，运用Uniport数据库校正潜在作用靶点基因名，去除重复基因并删除非人源性靶点，最终得到329个四逆散潜在活性成分靶点。

2.3 CHB靶点收集 在GeneCard、OMIM数据库中以“chronic hepatitis B”关键词进行检索，分别检索到8 016、454个靶点，将基因合并去重后获得8 361个与CHB相关的靶点。

2.4 有效成分-靶点网络构建 四逆散潜在作用靶点与CHB靶点的交集靶点共296个，运用Cytoscape软件构建有效成分-潜在治疗靶点网络图(图1)，图中共包含423个节点，有效成分和靶点相互作用关系为1 840条边。计算CHB潜在治疗靶点degree值(即参与调控该靶点的化合物数量)，排名前5位的是：前列腺素内过氧化物合酶(PTGS2，degree=106.0)，雌激素受体1(ESR1，degree=85.0)，雄激素受体(AR，degree=75.0)，一氧化氮合酶亚型2(NOS2，degree=74.0)，过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG，degree=73.0)。这反映了有效成分-靶点网络图一方多靶、一靶多药的网络结构特点，说明四逆散采用多靶点、多路径、多环节的方式发挥治疗CHB的作用。

图1 用Cytoscape软件构建四逆散的有效成分-潜在治疗靶点网络图

2.5 PPI网络构建及核心靶点筛选 将296个交集靶点导入String数据库获得蛋白互作网络，得到TSV文件后导入Cytoscape软件中绘制PPI网络并进行网络拓扑分析，PPI网络共包含257个节点(39个靶蛋白未参与相互作用)，1 241条连接，degree值越大，其呈现的圆形面积大小越大(见图2a)；计算得到degree值中位数为7，故以degree值≥14为筛选条件，获得四逆散治疗CHB的核心靶蛋白(见图2b)，其中STAT3(degree=32)、JUN(degree=28)、MAPK3(degree=27)、MAPK1(degree=26)等，靶蛋白degree值大，反映节点及其周边节点的密集程度较高，在网络中发挥重要作用。利用Cytoscape软件中MCODE插件对筛选出的核心靶蛋白进行模块化分析，设置degree cutoff>2；K-Core设置为2，对其特征进行分析，筛选核心靶标模块(见图2c)。筛选出的模块具有更高的信息传递效率，单一靶点对其他节点的相互作用更强。

a:四逆散治疗CHB的靶点；b:四逆散治疗CHB的核心靶蛋白;c：核心靶蛋白进行模块化分析

2.6 GO和KEGG富集分析 将四逆散治疗CHB的296个靶点进行GO功能富集分析，根据保留P<0.05的结果，进行可视化分析，列出富集结果的前20位，绘制气泡图(图3)。GO功能富集分析显示，四逆散治疗CHB可能与内肽酶活性、酰胺结合、肽结合、泛素化蛋白连接酶结合、氧化还原酶活性等生物功能相关。这表明四逆散可能通过调控HBV的蛋白质转录、翻译等过程影响CHB的发生发展。

图3 四逆散干预CHB靶点GO富集分析

将四逆散治疗CHB的靶点通过R软件及clusterProfiler进行 KEGG富集分析，根据保留P<0.05的结果，进行可视化分析，列出富集结果的前20位，绘制气泡图(图4)。结果显示四逆散治疗CHB的作用机制可能乙型肝炎、白细胞介素17(IL-17)信号通路、细胞凋亡、Toll样受体(TLR)信号通路、Th17细胞分化等通路有关。这表明四逆散可能通过调控免疫应答及免疫细胞分化来调控CHB进程。另外，结果提示四逆散可能参与调控人类相关致病病毒所引起的疾病通路(如人类巨细胞病毒感染、丙型肝炎、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染)、癌症相关通路(如胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、肿瘤坏死因子信号通路)等。

图4 四逆散干预CHB靶点KEGG富集分析

3 讨论

本研究共筛选出四逆散139个主要有效成分。网络拓扑学分析显示，山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、异鼠李素(isorhamnetin)、甘草次酸(enoxolone)、黄柏酮(obacunone)、柚皮素(naringenin)拥有相对较多的潜在靶点数。山柰酚可以抑制内质网应激诱导的肝细胞凋亡，保护肝脏免受损伤[11]。Cheng等[12]通过在人肝癌细胞系的体外实验发现槲皮素可以抑制HBV抗原分泌和基因组复制，提示槲皮素可能是潜在的抗HBV药物。一项动物实验表明，异鼠李素可以通过P38 /PPAR-α通路抑制小鼠细胞的凋亡和自噬，从而起到保护肝脏的作用[13]。研究表明，甘草次酸通过促进其在肝细胞中的积累，增加其在细胞质和细胞核中的分布，从而增强恩替卡韦的抗病毒效率，且不影响恩替卡韦的血浆药代动力学[14]。总体而言，四逆散可能通过上述核心成分抑制HBV的复制，从而干预CHB进程，并对肝脏具有一定保护作用，可预防或延缓肝脏因反复炎症损伤向肝纤维化、肝硬化进展。

在筛选出四逆散治疗CHB的257个直接作用靶点中，STAT3与四逆散有效成分相互作用最为密切，其次是JUN、MAPK3、MAPK1等。Yang等[15]通过体外实验发现，早期HBV感染过程中，STAT3可以促进HBV复制。在慢性HBV感染过程中，血清中HBsAg能够结合在NK细胞表面，通过抑制STAT3信号通路活化，降低活化性受体NKp46的转录水平，最终导致NK细胞功能受到抑制[16]。Dai等[17]发现激活HBV转基因小鼠中的p38 MAPK和JNK通路可能与促进辅助性T细胞1(Th1)分化和抗病毒免疫有关。既往体外实验证明，MAPK1/3信号通路通过下调HNF4α参与抑制HBV转录和复制[18,19]。

四逆散在治疗CHB过程中主要涉及的通路可能是IL-17信号通路、TLR信号通路、Th17细胞分化。IL-17是一种由Th17细胞分泌的细胞因子，在CHB患者病情进展中起到重要作用[20]。研究[21]表明，IL-17在CHB患者中明显升高,同时IL-17与HBV DNA病毒载量呈正相关性, 且IL-17参与并激活IL-6/STAT3信号通路，提示IL-17参与HBV的复制和表达，抑制机体对HBV的免疫清除，导致CHB患者免疫系统功能障碍加重，从而加重肝损伤。此外，赵霞等[22]研究发现，CHB患者外周血IL-17水平随炎症加重而升高，可能对肝硬化、慢加急性肝衰竭的疾病进展有促进作用。Th17细胞释放多种炎性细胞因子，可以激活原代肝星状细胞，进而发挥在HBV慢性感染中的致病作用[23]。TLR感知病原体相关的分子模式并激活抗病毒机制，在先天免疫反应中起到至关重要的作用。其中TLR3途径的激活导致干扰素(IFN)-β的产生，进而在转录及转录后步骤中抑制HBV复制，TLR4信号和TLR2信号通络激活细胞内信号通路(如MAPK通路)，以IFN依赖性方式抑制HBV复制[24]。TLR7激动剂可以通过诱导I型IFN的抗病毒细胞因子来诱导HBV的长期抑制[25]。

综上所述，本研究应用网络药理学的方法系统预测了四逆散治疗CHB的机制，通过对四逆散的有效成分、潜在靶点及靶点富集分析进行综合分析，发现四逆散主要通过调控免疫应答抑制HBV复制及转录，并能抑制炎症反应，保护肝脏结构，从而在治疗CHB中发挥作用。但其作用机制仍需进行大量临床及科学研究进一步验证，以提高临床用药的合理性和科学性。