鱼露发酵技术及风味研究进展

2021-02-25白妞妞白锴凯何建林洪碧红张怡

中国调味品 2021年2期

白妞妞，白锴凯，何建林，洪碧红*，张怡

(1.福建农林大学食品科学学院，福州 350002；2.自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心，福建厦门 361005)

鱼露是一种类似于酱油的调味料，外表呈褐色液体，风味独特，不同的原料和发酵过程产生了不同气味和颜色的产品。我国很多地区均有鱼露生产，福建省以其优越的地理条件盛产鱼露，销售到各个国家。在泰国，鱼露是最受欢迎的酱料，几乎每个家庭都用它作为调味品或烹饪调味料。在汤、卤汁和饺子中加入鱼露不仅能够增加风味，还能增加烟熏味，丰富度等。因此鱼露在全球范围内也越来越被人们所接受，成为我国沿海地区、东南亚和日本居民的主要膳食调味料之一。

1 鱼露发酵技术

1.1 鱼露传统发酵技术及存在问题

在过去的几十年里，我国渔业一直在持续增长，并产生了大量的副产品，这些副产品来自鱼头、鱼皮、鱼骨、鱼刺和内脏。其中一部分被加工成饲料、胶原蛋白、生物燃料和化肥，但许多其他高价值的生物活性化合物未加以回收利用[1]。传统鱼露是利用低值鱼(蓝圆鲹、沙丁鱼、巴浪鱼)、虾或者工业下脚料鱼头、鱼肝或鱼内脏为原料，加入30%～40%的盐，放置在太阳底下暴晒，发酵1年左右而制成的鱼酱油制品[2]。每年的农历2月和8月是制作鱼露的最佳时间，这个时候空气中水分少，盐分和鱼肉及菌类能够在时间的流逝中慢慢融合，自然发酵，并逐渐在酶的作用下分解出营养价值极高，富含蛋白质和氨基酸，此外还有牛磺酸、有机酸和微量元素的鱼露。但是，由于不同地方生产的鱼露品质不同，有的重金属如铅、镉、砷等超标，有的甚至因生物胺超标而引起腥臭味等，对鱼露的品质造成极大的影响。姜华军等[3]采用微波消解结合电感耦合等离子体发射光谱法(CP-OES)测定了鱼露样品中的元素成分，结果显示，鱼露样品中含有13种金属元素，且大多为铅、镉、砷、镍等重金属元素。

传统发酵鱼露具有良好风味的同时也产生了一系列问题：第一，传统鱼露发酵周期长，一般要发酵2～3年，产量低下；第二，由于传统发酵技术在发酵过程中不添加任何酶类，发酵过程不定向从而导致鱼露营养不够全面；第三，鱼露在自然发酵过程中由于微生物或酶的作用会发生一系列生化反应从而产生具有不良风味的代谢产物，这些化合物给鱼露带来独特的腥味、汗味、酸味等，严重限制了它的可接受性。因此，寻找改善鱼露风味的方法对食品工业具有重大意义。

1.2 鱼露快速发酵新技术

针对传统鱼露发酵存在周期长、不定向等问题，近年来很多科研工作者研究了鱼露快速发酵新技术，其目的是为了保持鱼露在短时间内完成发酵的基础之上，还能够保持鱼露的独特风味[4]。

保温发酵技术是指将温度维持到适宜鱼体水解的最适温度，利用鱼体内的内源性酶将蛋白质、脂肪、糖类等大分子物质水解为氨基酸、单糖、酯类和醇类等小分子物质，从而提高鱼露营养价值和风味物质的一种发酵技术。国内外学者研究了鱼蛋白在恒温条件下的水解情况，发现在恒温条件下能够加快鱼蛋白的水解速率，并将此方法应用到鱼露发酵过程中，在鲭鱼中添加水产品加工废弃物，并保持温度30 ℃或光照条件下进行发酵，最终测定游离氨基酸组成与商品中氨基酸组成成分不同，但在气味、味道等方面均能被消费者接受。该方法有效利用水产品加工废弃物，缩短了鱼露的发酵周期。

1.2.2 外加酶发酵技术

外加酶发酵技术是在鱼蛋白自溶过程中，引入适量的外源酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等加速鱼露发酵或改善鱼露风味的一种发酵新技术。发酵鱼产品在东南亚国家非常受欢迎，这些产品具有独特的特性，尤其是在发酵过程中产生的香气、风味和纹理。而蛋白水解酶对形成这些香气、风味和纹理起至关重要的作用。Gao Ruichang等[5]对嗜盐古菌产的一种胞外蛋白酶进行了纯化和表征研究。质谱分析表明该蛋白酶与盐卤菌蛋白酶具有某些共同的功能特征，是一种具有耐碱性和耐盐性的酶，能高效水解鲢鱼肌球蛋白，这些优良的特性使该蛋白酶成为工业生产低盐鱼露发酵的理想原料。Zeng Xuefeng等[6]在中国传统的低盐发酵全鱼产品“酸鱼”中分离得到27株木糖葡萄球菌，分离物被证明对肌动纤毛蛋白和肌浆蛋白有适当的蛋白水解活性，且具有耐低温、耐盐和抑菌功能。将其接种到鱼糜培养基上发酵72 h，发现鱼糜中游离氨基酸含量有了显著的提高，风味也得到了改善。

1.2.3 微生物发酵技术

微生物发酵技术是在鱼露的自然发酵过程中，通过引入适量产蛋白酶、淀粉酶等外源酶来源的微生物，如加入产蛋白酶的芽孢杆菌或米曲酶等，加速鱼蛋白或其他大分子物质的分解，从而缩短鱼露发酵时间或增强鱼露风味的一种发酵新技术。Zhao Jiuxiang等[7]以黑曲霉、米曲霉(FSB，Aspergillusoryzaekoji∶Aspergillusnigerkoji为3∶1)和米曲霉(FSA，Aspergillusoryzaekoji)接种淡水鱼露，发酵结束后，FSB发酵鱼露的氨基酸、总可溶性氮、游离氨基酸(FAA)和谷氨酸的含量较FSA分别增加7.50%、7.84%、9.80%和28.43%。结果表明，采用混合霉菌发酵方法生产鱼露是一种有效的方法，可以加速发酵过程，改善淡水鱼露的风味。Ohshima等[8]用16S rRNA新一代测序法检测了泰国鱼露在发酵不同阶段的细菌菌群特征，发现发酵罐中的原料来源和细菌菌群影响了整个发酵过程中存在的细菌种类，从而影响了产品的独特特性。

2 鱼露的风味物质研究

2.1 鱼露的风味

鱼露作为日本和东南亚地区人们最常见的调味品，之所以能够延续至今，是由于它独特的鲜味和香味备受人们的喜爱。但是，仅仅由于这些简单呈味物质的组合并不能供给足够的风味，必须要通过水产原料发酵形成的复杂体系共同作用，才能形成具有独特风味的鱼露。Kim等[9]从亚洲国家购买5种不同的传统酱料(美居酱油、酿造酱油、鱼酱油、石鱼酱油和凤尾鱼酱油)腌制猪肉样本，4周后，凤尾鱼酱油腌制猪肉中愉快味道化合物的数量显著高于其他酱油腌制样本，同时，与其他酱料相比，凤尾鱼酱油的腌制在一定程度上增加了肉制品中的风味化合物成分。

该文从构造特征、沉积体发育规模、储层孔隙度下限等地质特征入手，分析该油田的不确定性因素，并确定其分布范围，以地质模型为载体，分析其对储量的影响，开展不确定性分析，确定储量分布的P10，P50，P90(一个油田的储量分布符合正态分布，P50指最可能出现的值，出现概率最大，也叫推荐值；P10和P90出现概率较小，P10代表储量低值也叫悲观值，P90代表储量高值也叫乐观值)。

2.1.1 鱼露的鲜味

鱼露中含有17～18种氨基酸，不同的氨基酸对鱼露的鲜味有不同的贡献作用，最终形成了口味独特的鱼露。Yung等[10]曾研究了发酵鱼露对泡菜发酵的影响，利用核磁共振氢谱(1H NMR)对泡菜的代谢产物进行分析，结果表明，含有发酵鱼露的泡菜中氨基酸和-氨基丁酸(GABA)含量较高，醋酸盐、乳酸盐和甘露醇含量也增加得较快，可见鱼露可作为良好的鲜味剂。此外，为了提高鱼露的鲜味，许多研究者试着采用将产谷氨酰酶活力高的菌种接种到鱼露中的方法来代替直接加谷氨酰酶或酱油曲。目前，日本的一些研究者已经利用此方法筛选出了一株产谷氨酰酶活力高的耐盐性枯草芽孢杆菌并应用于鱼露的发酵过程中。鱼露鲜味主要来源物质的特点及作用见表1。

表1 鱼露鲜味主要来源物质的特点及作用Table 1 The characteristics and functions of main source substances of fish sauce umami

2.1.2 鱼露的香味

鱼露的香味由酯类和醇类物质组成。其香味来源有：原料鱼自溶生成，曲霉发酵产物生成以及原料鱼在发酵过程中微生物如乳酸菌和酵母菌经过一系列复杂的生化反应产生的代谢产物。Mohamed等[11]采用DB-WAX和HP-5MS双色谱柱分析了马来西亚鱼露中的挥发性成分，检测到了44种挥发物质，其中3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、二甲基二硫、3-(甲基硫)-丙醛、3-甲基丁酸和苯并乙醚由于其较低的阈值而被认为是具有芳香活性的化合物。

2.2 鱼露发酵过程及风味物质形成机理

2.2.1 鱼露的发酵过程

鱼露发酵过程主要经历3个阶段：第一阶段为成分降解即液化阶段，第二阶段是营养物质的产生及形成阶段即代谢产物形成阶段，第三阶段即为产物再平衡阶段。不同阶段的酶在发酵不同阶段有不同的作用。发酵前期的酶是依靠微生物代谢产生的，在这些酶的作用下分解大分子物质，即蛋白质变性，可溶性蛋白和糖在此阶段溶出，此类物质为后期酵母菌和乳酸菌的生长提供了营养。淀粉在酶的作用下产生的多糖类与氨基酸进行美拉德反应，产生棕色色素。发酵后期，乳酸菌和酵母菌共同作用，在各类酶的催化作用下，形成一系列风味成分。鱼露在发酵过程中离不开各种酶的水解作用，这些酶的主要来源可分为两种：一种是由鱼体本身存在的酶对自身鱼蛋白的酶解作用，称为内源酶；另一种是为了加速发酵过程、改善风味而人为添加的一类酶，可以从微生物中分离得到，也可以在市场购买，这类酶活力高、定向性好。

2.2.2 鱼露风味物质形成机理

鱼露发酵过程经过一系列生化反应而形成挥发性风味物质，其主要生化反应包括美拉德反应、脂肪氧化、Strecker降解、微生物代谢等。目前通过在鱼露中添加微生物或几种复合微生物来改善鱼露的风味已成为研究鱼露的主要方向。鱼露中风味物质形成的主要途径见图1。

图1 鱼露中风味物质形成的主要途径Fig.1 The main ways of the formation of flavor substances in fish sauce

有研究表明，鱼露中的葡萄球菌(Staphylococcussp. CMC5-3-1)通过代谢2-甲基丙醛增强了鱼露的特征香气，奥默柯达酵母(KodamaeaohmeriM8)的代谢物增强了鱼露的奶酪香味、肉香味。枝芽孢杆菌属(Virgibacillussp. SK37)的代谢物使鱼露产生了独特的麦芽香和黑巧克力香。米曲霉(AspergillusoryzaeOAY1)的代谢物2-甲基丁醛、戊醛、己醛、苯甲醛等挥发性物质的产生使得鱼露发酵3 d即可达传统鱼露香气。而木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)的代谢物的产生不仅消减鱼腥味、铁锈腥味、酸败味，还可以降低一些对人体有害物质的含量。

3 微生物对鱼露的影响

鱼露发酵的速度和最终形成的风味都与其发酵过程中的微生物密不可分。Du Fangming等[12]首次利用高通量测序技术揭示了中国传统鱼露(traditional Chinese fish sauce，TCFS)发酵过程中细菌群落的动态变化。在TCFS发酵的早期阶段，变形杆菌内的Shewanella希瓦氏菌属(约90%)是优势菌群。到第12个月，厚壁菌门内的halan厌氧菌(3%～86%)迅速取代希瓦氏菌成为优势属。在发酵后的第3个月和第9个月检测到大量属于厚壁菌门的乳球菌(3.31%)和芽孢杆菌(45.56%)。在后期(12～15个月)，厚壁菌门内的四联球菌取代厌氧菌属成为最主要的细菌(29.54%)。采用偏最小二乘回归(PLSR)方法，研究了氨基酸、游离氨基酸、总可溶性氮、三甲胺(TMA)等主要功能物质与细菌群落的关系。四联球菌与TMA的形成呈正相关，而卤菌属则相反，表明四联球菌可能是一种很好的TCFS发酵剂。王炳华等[13]也利用高通量测序并结合荧光定量PCR法分析了鳀鱼鱼露发酵过程中微生物菌群情况，发现厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、放线菌门等是鳀鱼在发酵过程中产生的主要微生物菌群。这些结果有助于我们了解TCFS发酵过程中细菌的参与，有助于提高发酵海鲜的质量。

3.1 利用微生物加速鱼露发酵

3.1.1 细菌加速鱼露发酵

细菌各种各样的代谢方式在鱼露发酵过程中产生了重大的作用。Zheng Bin等[14]为了研究在发酵过程中提高鱼露质量的方法，从鱼露中分离得到了一株产蛋白酶嗜盐冷杆菌(Psychrobactersp.)，发现该蛋白酶产菌对pH和NaCl浓度变化影响不明显，却显著提高了中嗜盐微生物总数、蛋白酶活性、可溶性总氮含量和氨基酸总氮含量，加速了鱼露发酵，增强了鱼露的鲜味和肉味。此外，接种冷杆菌显著降低了总挥发性碱性氮含量和生物胺含量，具有增强风味特性和非生物胺生成活性。

3.1.2 霉菌加速鱼露发酵

霉菌主要是通过产生淀粉酶和蛋白质水解酶对淀粉和蛋白质进行水解从而加速鱼露的发酵过程。其中米曲酶、黄曲霉和黑曲霉是生活中最常用的发酵剂，而在鱼露的发酵过程中也起到了至关重要的作用。Kim等[15]通过10个月的试验，研究了不同盐浓度(10%和20%)条件下，接种曲霉菌的稻曲对鳍鱼酱油生化和感官特性的影响。结果表明，与不使用大米曲的鱼酱相比，用大米曲和低盐浓度配制鱼酱不仅缩短了发酵过程，且味道、风味和整体接受度更好。童光森[16]在鳙鱼中添加用米曲霉制备的曲液，仅发酵30 d就制备出了口感和风味良好的鲜辣鱼露。

3.1.3 酵母菌加速鱼露发酵

酵母菌是生活中最常见的发酵剂，例如面团发酵、啤酒发酵、酸奶发酵等。在鱼露发酵过程中酵母菌由于兼性厌氧的特点加速了发酵过程。Gao Pei等[17]以产自四川的酿酒酵母31和植物乳杆菌120、木糖葡萄球菌135为发酵剂发酵鱼露，挥发物经顶空固相微萃取(SPME)提取、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析表明，酯类和醇类是挥发物的主要成分，占所有样品的50%以上，酿酒酵母31、植物乳杆菌120和木糖葡萄球菌135可促进发酵。王炳华等[18]在鳀鱼鱼露发酵的前期添加了10%的球形球拟酵母，3 d后得到了具有浓郁鲜香味的鱼露产品。

3.2 利用微生物改善鱼露风味

传统鱼露之所以会产生独特的风味是由于鱼露本身的微生物或酶会将鱼露原料中的蛋白质、脂肪成分分解、发酵和进一步反应，从而形成具有鲜味和香味的化合物体系。缩短周期，会影响鱼露的风味，因此，在鱼露发酵过程中加入能够产生风味物质蛋白酶的微生物是鱼露快速发酵技术的关键条件。细菌、霉菌和酵母菌都对鱼露的独特风味有着巨大的贡献，鱼体在这些微生物产生酶的作用下，将体内的大分子等物质分解为易吸收的氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等小分子物质，从而提高了鱼露的风味和营养价值。Wakinaka等[19]利用含溴甲酚紫的天冬氨酸指示液从鱼发酵食品中分离得到74株菌株，经PCR扩增，均鉴定为嗜盐四联球菌，并确认其具有天冬氨酸脱羧酶基因(aspD)，根据其aspD编码质粒的结构，将其分为14组。将从每组中选择的菌株和不能进行天冬氨酸脱羧的对照菌株接种到鱼露醪中作为发酵剂，分离出具有aspD的菌株在鱼露醪液中几乎完全将天冬氨酸转化为丙氨酸。此外，该菌株与对照菌株一样，阻止了生物胺的积累，而各种胺在没有发酵剂的鱼露醪液中积累。综上所述，使用具有天冬氨酸脱羧酶的嗜盐嗜血杆菌作为鱼露发酵发酵剂，会将天冬氨酸转化为丙氨酸，改善鱼露的口感、风味，阻止鱼露产品中生物胺的积累。

3.2.1 细菌改善鱼露风味

鱼露自然发酵过程中涉及到很多细菌，不同的细菌对鱼露的风味起着不同的作用。Wang Yueqi等[20]从鱼酱样品中提取了22816个代谢物离子特征，其中46种代谢物被鉴定为鱼露的关键化学成分。这些化学成分大多数来源于细菌的代谢产物。此外，绝对定量和味觉活度值(TAV)表明，天冬氨酸和谷氨酸对鱼露的鲜味有重要影响。李梦茹等[21]以模拟鱼露为基础接种细菌，并测定其中的挥发性成分，发现戊糖片球菌能有效地改善鱼露的风味。

3.2.2 霉菌改善鱼露风味

霉菌对鱼露风味的影响主要表现在鱼露发酵的前期，鱼露在发酵前期主要涉及到一种霉菌——米曲霉，米曲酶属于黄曲霉种属，是我国传统酿造酱油的主要菌种，在酱油酿造过程中，米曲霉分泌大量蛋白酶等酶类，形成良好风味的酱油。影响米曲酶生长条件的因素主要是温度、水分和pH，尤其是水分，34%～45%的水分是米曲酶生长的最佳水分条件。产酶的最适温度为28～30 ℃。另外在酿酒过程中，米曲酶还可以被作为糖化酶。Ole G M等[22]以鲭鱼为基础发酵鱼酱，并以日本曲母为基础的真菌接种促进了发酵，对发酵产品进行化学分析后结果表明，有21种不同的酱料含有大量的谷氨酸和天门冬氨酸，形成鱼露浓郁的鲜味。

3.2.3 酵母菌改善鱼露风味

鱼露在发酵过程中会产生大量的酵母菌，酵母菌株可分为很多种，不同的酵母菌种发酵后得到的代谢产物不同，这些代谢产物主要包括醛类、酯类、醇类和双乙酰类等。酵母菌含量、降糖速度和酯酶活性都直接或间接影响酵母发酵后的风味成分。酵母菌对鱼露风味的影响主要表现在鱼露发酵的中期和后期。其主要可分为啤酒酵母菌和酿酒酵母菌，啤酒酵母菌的代谢产物中含有丰富的营养物质蛋白质、核糖核苷酸和多糖，水解后的代谢产物为鱼露提供了鲜味。酿酒酵母菌虽然形态简单，但生理却很复杂，代谢方式和途径也各种各样，这为鱼露发酵过程良好风味物质的产生奠定了基础。Gao Pei等[23]在罗非鱼鱼头水解液中分别添加3个酒酵母、1个乳制品酵母和1个酱油酵母进行比较，不同酵母表现出不同的生长动力学和发酵性能。结果表明，非酱油酵母可用于鱼露调味料的复合改性，开发出一种快速发酵鱼头无盐鱼露的工艺，提高鱼副产品的利用率，改善鱼露的风味。